文档介绍：植酸酶的生产及应用
植酸酶的性质
植酸酶是一种能水解植酸为肌醇和磷酸的一类酶的总称,它具有特殊的空间结构可将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸,属于磷酸单酯水解酶。是胞外酶。
其分子量因来源不同存在很大差异,这主要是由于糖基化的原因造成的。植酸酶基因在不同的表达系统中, 糖基化程度不一样。
植酸酶的理化特性
最适PH:
植酸酶的最适pH 值一般在2~6 之间。植物来源的植酸酶最适pH 为4. 0~7. 5 ,大多数在5. 0~6. 0 。细菌来源的植酸酶最适pH 一般为中性或偏碱性。真菌植酸酶为2. 5 ~ 7. 0。
最适温度:
植酸酶最适温度在40~60 ℃范围内。
植酸酶的理化特性
激活因子及抑制因子
多数二价阳离子(Ca2+ 、Fe2+ 、Zn2+ 、Mg2+ 、Cu2+等) 因与底物(植酸) 发生强烈的络合作用而抑制酶的活力。草酸、柠檬酸等化合物也因与酶活性中心关键氨基酸的侧链基因反应而降低酶活,常见的底物竞争性抑制剂等的出现也会对酶的作用效果产生不利的影响。
对于有的植酸酶,则存在某种特定的金属离子可以作为电子转移载体起到酶的激活剂的作用, 如Fe2+激活酿酒酵母, Ca2+激活枯草杆菌植酸酶等等。
植酸酶催化机制
胍基中的正电荷直接及底物植酸的磷酸基团相互作用,使其对亲荷攻击更敏感。在共价连接的磷-组氨酸中间物中,组氨酸残基作为亲荷物质。C-末端序列HD的天门冬氨酸残基提供质子给底物,释放磷。
杆状菌植酸酶催化机制存在特殊性,其稳定性与活性依赖于Ca2+ 。
杆状菌植酸酶催化机制
植酸通过双降解途径产生三磷酸肌醇。
途径一:酶依次从3-位和1-位将磷酸盐水解下来,将第一个磷水解后,酶及底物分离,然后底物再结合到酶的活性位点水解第二个磷,产生中间物2,4,5,6-四-磷酸肌醇,再将5-位磷水解下来,得到产物2,4,6-三-磷酸肌醇。
途径二:首先是依次将6-位和4-位的磷水解,得到的中间产物1,2,3,5-四-磷酸肌醇释放后,再与酶结合,将2-位磷水解,得到终产物1,3,5-三-磷酸肌醇
植酸酶高产菌株选育
目前,植酸酶生产主要是利用微生物发酵。
由于天然菌种的植酸酶产量较低,无商业利用价值。目前都是以天然菌株进行改良获得的改良菌或通过基因工程技术获得的基因工程菌。
Marisa K. Che - lius 等用紫外照射法对无花果曲霉Asp . ficuum (NRRL31155)菌株进行改良,获得的突变菌株其植酸酶产量为野生型的3. 3 倍。
此外,可以直接从自然界筛选、亚硝基胍处理、复合处理、钴照射诱变等方法获得高产菌株。
植酸酶高产菌株选育实例
从自然界筛选高产菌株:
(1)、初筛
采集各地土壤样品各取10g溶于50mL生理盐水,80℃煮沸8min,菌液稀释涂布于初筛平板。挑取产生较大水解圈的菌落,再次划线分离,将单菌落保存于斜面培养基。
(2)、菌种复筛
挑取斜面菌落,经种子发酵培养,用偏钒酸铵法测定植酸酶活力。挑选活力最高的菌株,保存。
植酸酶高产菌株选育实例
(3)种子培养
活化甘油管保存菌种,接种于种子培养基。种子培养条件为50 mI/250mL,温度37℃,摇床转速160dmin,培养时间24h。
(4)摇床发酵培养
按8%接种量接种,培养条件为50 mL/250 mL,温度34℃,摇床转速160 r/min,培养时间72 h。
植酸酶高产菌株选育实例
5)、酶活测定
制作定磷标准曲线。取发酵液10mL,4000 r/min离心15 min去菌体,10倍稀释: mL稀释液+ mL Tris—HCI()+4mL植酸钠(2 mmo1/L),55℃反应30 min,再加入4 mL反应终止液。显色10 min。4000r/min离心10 min。波长415 nm处测定OD值。