文档介绍：胃蛋白酶
猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定
一、实验目的
1、掌握等电点沉淀、盐析及离子交换层析原理及操作。
2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程。
3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及
SDS-聚丙烯酰***凝胶电泳技术。
二、实验原理
胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中,在Ca2+的存在下,被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开,失去一段六肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。猪胰蛋白酶的分子量约为23400,,~,胰蛋白酶在pH3条件下较稳定,在pH5以上易自溶,Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用,在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。本实验以猪胰脏为材料,首先用酸性水溶液抽提组织,在Ca2+离子存在条件下,以少量胰蛋白酶结晶激活所得的酶原,再以硫酸铵盐析获得粗胰蛋白酶。经过透析除盐,以羧***纤维素柱阳离子交换层析进行纯化,即可获得较纯的胰蛋白酶。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解,对于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰***键或酯键,其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏
感性次序为:酯键> 酰***键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰***或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力,其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三***乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收值做对照,根据酶活力蛋白的定义,确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义:在一定条件下每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在280nm处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位(U)。
三、试剂和器材
1、试:(1):在酸度计监测下,向蒸馏水中加入乙酸,使pH达2 .5。2)10%(V/V)HAc 溶(3) mol/L H2SO(4)5 mol/L NaOH(5)2 mol/LHCl(6) mol/L HCl (7) mol/L , ,柠檬酸钠缓冲液:量
( g H3H5O7·H2O/L),加59 mL (.9 g Na3C6H57·2H2O/L)混匀,。(8) mol/L , ,柠檬酸钠缓冲液2 mL ( g
H3C6H5O7·H2O/L), mL g Na3C6H5O7·2H2O/L)混匀,。(9) mol/L , ,柠檬酸钠缓冲液:量取19 mL (21 g H36H5O7
·H2O/L)加入81 mL (29 g Na
3
C
6
H
5
O
7
·
2
H
2
O/L
)混匀,
用酸度计检查
pH
值是否为
。
(
10
)
8
%三***乙酸
(
11
)
10 mg/mL
酪蛋白溶液:
取酪蛋白
1g
,
加
13 mL mol/L NaOH 溶液
,
M
Tris
-
HCl
缓冲液,
40
mL
,置
8
5
℃水浴加热至溶解,放至室温后,加上述缓冲液 40 mL
,
用
1
N HCl
小心调 pH
为
,用缓冲液定容至
100 mL 。
(
12
)
不同
pH
值缓冲液的的配制Ⅰ
M
磷酸缓冲液:
、
、
、
a.
M
磷酸氢二钠的配制:
称取
Na
2
HPO
4
·
12H
2
O
(
g/mol )
g 加水定容至 500 mL b.
M
磷酸二氢钠的配制:
称取
NaH
2
PO
4
·
2H
2
O ( g/mol )