文档介绍：蛋白酶产生菌细菌的分离与鉴定
蛋白酶产生菌细菌的分离与优化
一、研究背景及进展
蛋白酶已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶,既节省时间,又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用,如用胃蛋白酶治疗消化不良,用酸性蛋白酶治疗支气管炎,用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品,含碱性蛋白酶,能去除衣物上的血渍和蛋白污物,但使用时注意不要接触皮肤,以免损伤皮肤表面的蛋白质,引起皮疹、湿疹等过敏现象。
二、实验方案
1 材料与方法
材料
菌株
B1 分离自污水河的土壤;B9 为B1 物理诱变后所得的菌株。
药品
弹性蛋白、刚果红弹性蛋白 Sigma 公司产品。
培养基
细菌富集培养基(% W/V)
,,NaCl ,,121℃灭菌20min。
初筛培养基(% W/V)
,,,K2HPO4 ,KH2PO4 ,MgSO4·7H2O ,,115℃灭菌30min。
发酵培养基(% W/V)
,,,K2HPO4,,MgSO4·7H2O ,,11℃灭菌30min。
胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选方法
细菌富集培养
称取土样1 g ,加入细菌富集培养基中,送摇床培养,150r/min,37℃培养48h。同时做两个平行实验。
分离
将富集土壤悬液按每级稀释10 倍的次序得到10- 3、10 - 4、10 - 5 的系列稀释液, 稀释液,加到相应的培养皿内,用涂棒涂匀。每个稀释梯度做两个平行试验,3 7 ℃培养箱倒置培养48h。
弹性蛋白平板初筛
将得到的单菌落用牙签点到弹性蛋白平板上,送37℃培养箱培养48h,观察有无透明圈产生。选择细菌水解弹性蛋白所形成的透明圈直径与菌径之比较大的菌落进行诱变实验。
菌种鉴定方法
根据《微生物分类学》和微生物菌种鉴定实验进行鉴定。
弹性蛋白酶活性测定方法
采用Sachar[5]方法并参照我国现行药用弹性蛋白酶测定方法加以改进。该法以与染料偶联的不溶性底物经酶作用而溶解至水相,反应上清液的光密度反应底物被消化的程度。取10mg 刚果红弹性蛋白- 弹性蛋白溶于1ml水中,加1ml , 的硼酸缓冲溶液,取1ml 适当稀释的酶液于37℃下振荡反应20min,, 磷酸钠缓冲溶液2ml 终止反应,过滤后取上清液测495nm 处的光密度,以不加酶液和底物的反应系统为空白。在此反应条件下溶解1mg 刚果红弹性蛋白- 弹性蛋白底物,所需的酶量定义为一个弹性蛋白酶活性单位(U)。
2 结果与分析
菌株筛选
弹性蛋白平板筛选
观察产生透