文档介绍：免疫组织化学技术
免疫组织化学技术
基本原理
通过免疫学中抗原抗体结合反应,用特异性抗体(单克隆或多克隆)检测组织、细胞内相应的抗原物质,形成抗原—抗体复合物;此复合物上带有事先标记的标记物,通过与标记物相对应的检测系统,如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色,从而可检测组织细胞内的抗原,以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。
组织与细胞材料的制备
免疫组织化学方法
组织与细胞材料的制备
组织石蜡切片制作
组织冰冻切片制作
细胞爬片制作
细胞涂片制作
切片的制作
组织的固定
组织石蜡包埋
切片
目的:
(1)防止组织细胞的死后变化,防止自溶和腐败,以保持组织细胞
的固有形态。
(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶
性物质,以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的
死后变化,防止自溶和腐败,以保持组织细胞的固有形态。
(3)使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率,造
成光学上的差异,以便染色后易于鉴别和观察。
(4)固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制
片。
(5)防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。
(6)经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰,便 于辨认。
组织材料的固定
固定液的选择:
(1)甲醛固定液:10%福尔马林,10%中性福尔马林,10%中
性缓冲福尔马林
(2)4%多聚甲醛固定液
(3)Bouin S液及改良Bouin S液
(4)Zenker S液
(5)Zamboni S液
(6)PLP固定液:过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂
较适合富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保
存较好。
(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml,%重铬酸25ml。
(8)Kanovsky S液
(9)Methacarn固定液,对核内抗原的保存效果较好。
(10)PEG液
(11)%对苯醌
(12)碳二亚酰胺-戊二醛(ECG-G)液
(13)丙酮及醇类固定剂
固定时间:
固定时间要视组织块的厚薄,固定液的种类及浓度,温度而定,原则上,组织块大小与固定时间成正比,固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。
大组织:75%乙醇30~120min,85%乙醇30~120min,95%醇Ⅰ 2h,95%乙醇Ⅱ 2h,95%乙醇Ⅲ过夜,无水乙醇Ⅰ30 ~60min,无水乙醇Ⅱ30~60min,无水乙醇Ⅲ60min~120min,二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min(可视观察结果而定),石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1~2h,石蜡Ⅲ2~3h。
小组织:75%乙醇30min,85%乙醇30min,95%乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h,无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min(肉眼观察),石蜡Ⅰ30min,石蜡Ⅱ30min,石蜡Ⅲ1~2h。
组织石蜡包埋
切片
载玻片的清洁:
市售载玻片需经清洁液泡24h,流水冲洗,系列乙醇浸泡,凉干涂胶,如需开展原位杂交,还需将玻片240℃烤2h。
切片粘合剂的使用: (1)多聚赖氨酸(分子量300KD):%浓度。 (2)APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷)
干净载玻片→丙酮5min →用镊子夹住浸入APES试剂(1ml+50ml丙酮) 1~3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好,室温或4℃保存备用。
(3)铬矾明胶液: 明胶5g H2O2 1000ml
(4)甲醛明胶液:40% H2O2 100ml