文档介绍：第三章组织化学的基本技术
 
组织化学发展到今天,它的技术多而复杂,但基本技术是容易掌握的。从样品的取材、固定剂的选择、切片的制备、孵育反应、各种溶液的配制以及光镜组织化学技术和电镜组织化学技术等,每项技术都有明确的要求和规范的操作程序。进行没项工作,应事先做好准备,按技术程序进行,可做一定的预备实验,效果稳定后,再开始实验研究,这样才能达到预期的科研效果。
一、     样品的取材
样品制备的第一步就是取材,取材的好坏关系到实验的结果。所以必须做好准备工作。如取材的器材;动物标本准备,一般轻微麻醉,迅速取材为好。现将取材的原则和具体要求分述如下:
⑴  刀剪锐利、洁净。
⑵快速、准确、尽量保持生活状态,力争1
分钟之内放入固定液,最迟不能超过3分
钟。要清楚取材的部位和内部,对病理
组织还应做到以下几点:
①   材部位必须是主要病变区。
②必须取病灶与正常组织的交界区
③必要时取远离病灶的正常组织做对照。
⑶一刀切取,切取应在蜡版或滤纸上进行,
避免拉锯、牵拉或挤压等动作。
⑷低温操作,防止自溶现象,通常以0℃-4℃
的低温条件下操作为佳。
⑸定位准确,取材时必须注意样品的定向和
定位,即头、尾、左、右以及上、下方向。
切好的样品贴放在滤纸片上,标记好定向标
志,防入预冷固定液内,或冰冻切片或短时
间冷冻保存。
⑹样品大小适当,,
免疫组织化学样品大约在:
2cm××[]。
-。
二、固定
 
固定是将组织尽可能保持原有生活状态以
适用于某些研究程序的一种方法。固定有
如下几方面的目的。
⑴不仅保持组织生前的形态结构,还要保持
结构的化学成分和活性。
⑵促使组织凝固、硬化,保持一定的形状、
体积。
⑶增加媒染作用,便于染色;增加折光率,
便于观察。
⑷杀死活细胞或活组织,以进行组织化学反
应。由于固定的上述目的要求,许多良好
的组织学固定液,却不能用于组织化学标
本,特别是酶组织化学标本和免疫组织化
学标本。

用于组织化学的固定剂有很多种,一
般可分为单纯固定剂和混合固定剂两大类。
所有的组织化学标本固定必须根据其性质及
所进行的组织化学反应选择适当的固定剂。
常用组织化学固定剂举例如下:
⑴醛类固定剂:甲醛、戊二醛;中性
福尔马林,多聚甲醛等。
⑵非醛类:丙酮、酒精、Zenker’s液
和Carnoy氏液等等。
应用固定剂时应查阅有关的文献资
料,对前人未做的方法应慎用。固
定剂穿透组织的速率有很大特异性,
不同的固定液其穿透组织速率可有明
显的不同(穿透因子不同):
t = k·de [t=时间;d=组织深度;
k、e为穿透因子(常数)]
3. 固定的方法
⑴原位固定法
原位固定法是在保持动物对其器官组织血液供应的条件下,边解剖边向所取样本的部位滴加预冷的固定液的一种方法。这种方法有益于组织细胞酶活性和结构的保存,不足之处是对动物刺激时间较长,因此应快速取样,断头处死动物。
⑵  浸透固定法
浸透固定法是将组织块浸泡在固定液内而固定的一种方法。在组织化学样品的处理上,对浸透的时间、温度有一定的要求,特别是免疫组织化学样品的要求更严一些。
⑶灌流故定法
灌流故定法是通过血管的途径,将固定液灌注到所要固定的器官组织内,将生活的细胞在原位及时的固定后,在摘取样品的方法。这种方法的特点是:快速、固定充分,但是对固定液的温度、压力及取材时间有严格的要求。
⑷培养细胞和外周血细胞固定法
培养细胞核外周血细胞的固定方法比较特殊,对培养细胞通常取盖片入37℃的 Hanks液中,漂洗两次(每次3—5min),洗除血清后,再置于甲醛缓冲固定液内10—30min。.如果进行电镜观察就以2%戊二醛固定或采取双重固定法。
外周血通常采用涂片,以甲醛缓冲固定液固定。电镜酶组化则须离心沉淀后,用戊二醛固定(具体法见第4,5,6章)。
4. 固定后的处理——漂洗
已固定的组织样品,在切片之前必须进行漂洗,其主要目的是洗去组织中存余的固定液。这样做有助于酶活性的提高,可避免样品下一步和其它液相的液体接触,引起组织的结构改变和酶活性的降低,漂洗要求最适的PH值、渗透压、温度和时间来进行,否则会影响试验的结果。
三组织切片技术
一般的组织化学染色切片厚度要求在5~7 µm左右,神经组织切片的厚度要求比较特殊,一般在20~100 µm之间,以便观察神经纤维的走行。对于不同的组化反应在切片制作上有不同的要求。目前的切片技术主要有:冰冻切片、石蜡切片、超薄切片(电镜学)。

冰冻切片是