文档介绍：基因敲除
基因敲除和基因嵌入技术
该技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种,类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列,整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变,也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换,它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点,用同源序列的目的基因整个置换内源基因。目前用于基因敲除和基因嵌入的技术有Cre/Lox P系统、FLPI系统等。
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基因敲除(knock-out)
基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的,是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种新分子生物学技术。所谓胚胎干细胞(EmbryonicStem cell,ES)是从着床前胚胎(孕3—5天)分离出的内细胞团(Inner cellmass,ICM)细胞,它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能,能在体外培养并保留发育的全能性。在体外进行遗传操作后,将它重新植回小鼠胚胎,它能发育成胚胎的各种组织。而基因同源重组是指当外源DNA片段大且与宿主基因片段同源性强者并互补结合时,结合区的任何部分都有与宿主的相应片段发生交换(即重组)的可能,这种重组称为同源重组。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。这项技术的诞生可以说是分子生物学技术上继转基因技术后的又一革命。尤其是条件性、诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因靶位时间和空间上的操作更加明确、效果更加精确、可靠,它的发展将为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究、治疗手段,具有广泛的应用前景和商业价值。现在基因敲除技术主要应用于动物模型的建立,而最成熟的实验动物是小鼠,对于大型哺乳动物的基因敲除模型还处于探索阶段。
简单的说基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。举一个简单的例子:比如有一段"序列":"1234567890"(原基因),敲除后为:"123 7890",一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因,如"ABC",则新的基因为:"123ABC7890";或者不插入基因直接连接,则为“1237890”。
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基因敲除基本步骤
利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为:
:现在基因敲除一般应用于鼠,而最常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用,最近来自于C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。c57BL/6小鼠种系等已经广泛的应用于免疫学领域,并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。
:把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因(如neo基因,TK基因等)的载体上,此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的目的不同,此载体有不同的设计方法,可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体D