文档介绍：实验序号
实验名称
质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳
实验时间
是否小组合作
是(√) 否( )

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(1)通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒;
(2)通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术;
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1)质粒DNA的提取:
(1)关于质粒:
质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等,且拥有自己的复制起始位点,可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制,而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。
(2)一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤:
①培养细菌,使质粒DNA大量扩增;
②收集和裂解细菌;
③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
(3)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理:
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
~,线性的DNA双螺旋结构解开而变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确;而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。
2)质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳:
(1)关于电泳技术:
电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此,电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一,其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖是一种海藻多糖,琼脂糖胶分离范围很大,但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度,应用标准的电泳技术可以分离
200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。%到4%之间,且琼脂糖凝胶浓度越大,凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离,而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。
(2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:
通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后,就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色,也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview 溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以