文档介绍：PCR技术的原理、操作及应用
湖南省疾病预防控制中心微生物检验科
黄一伟
什么是PCR
PCR: Polymerase chain reaction,即聚合酶链反应
是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术
PCR技术的发展历史
关于PCR 的文章首次由美国科学家
Kary Mullis等人在《Science》杂志上发表
《Science》杂志报道了耐热性DNA多聚酶 Taq酶(生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶)的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。
1993 Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。
PCR技术的原理 1
遗传物质:
细胞核染色体 DNA(脱氧核糖核酸和磷酸链和碱基构成)
碱基(A、T、C、G)是按双链螺旋排列的,碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。
比如人类体细胞中共有31亿个碱基对,%的差,人和人之间有3百万个碱基对的差别。
PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
PCR技术的原理 2
PCR反应的基本成分
包括7种基本成分:模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子
基本反应步骤:变性--退火--延伸
最后通过染料如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出
PCR技术的原理 3
1
2
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4
5
22
55
72
94
时间(min)
温度
(℃)
适温延伸
3
高温变性
1
低温退火
2
重复1~3步
25~35轮
目的DNA片段
扩增100万倍以上
DNA双螺旋
DNA单链
与引物复性
DNA变性
形成2条单链
子链延伸
DNA加倍
RT-PCR的原理
相对于PCR,在开始阶段增加步骤:RNA cDNA合成,是单链到双链的过程。
实时荧光定量PCR的原理 1
实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR) 是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
常用的荧光定量PCR试剂:
SYBR Green I
Taqman水解探针
实时荧光定量PCR的原理 2
基线(Baseline)
是指在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即基线。
光阈值threshold的设定
一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。
CT(Cycle threshold)值
表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小,反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表CT值。因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR的原理 3
Ct与初始模板的关系
固定循环数后,荧光信号与模板数成正比
初始DNA量越多, 荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少
起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系,根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量
阈值
104
103
102