文档介绍：中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2007,27(5):153~156
重组 PCR技术研究进展和应用
王皓康现江王琦
(河北大学生命科学学院保定 071002)
摘要重组 PCR是用聚合酶链反应体系来实现 DNA重组的技术。经过 20多年的发展,该技术
已形成三个各具特色的方法分支:重叠延伸拼接、跳跃 PCR和 DNA重排。近几年,以利用天然的
差异基因作为重组来源为目的,通过简化操作步骤、提高捕获变异的效率、借助于表面展示技术
和荧光探针技术搭建的高通量筛选平台,重组 PCR技术在基础研究和工程应用研究的众多领域
中的实用价值不断增加。
关键词重组 PCR 重叠延伸拼接跳跃 PCR DNA重排高通量筛选
中图分类号 Q789
DNA重组是基因工程的核心内容。除了为人所熟 shuffling这个名称本身就十分形象。它是将完整靶基
知的酶学重组外,PCR技术也被用于制备基因杂合体, 因打成随机碎片,成分混杂的碎片在热循环过程中互
并形成独特的重组 PCR方法体系,与前者相得益彰。为引物相互延伸,并倾向于以随机重排来恢复原基因。
随着分子改造和体外定向进化等工程策略的出现,这根据上述三个策略可以归纳出重组 PCR的三个阶
项技术的应用受到越来越多的关注。段:(1)制备用于重组的 DNA组件;(2)组件分子作为
1 重组 PCR的概述巨引物互为模板延伸(无引物的热反应);(3)克隆和定
向筛选重组产物。图 1分别描绘了三种策略产生嵌合
在 PCR反应的退火过程中,具有 3′末端同源序列分子的过程。
的异源 DNA(不完全延伸的引物或模板碎片等)可能产
生链间退火并各自提供 3′羟基作为引物沿另一 DNA 2 重组 PCR和筛选方法的进展
链延伸。这类体外反应中的“模板转辙”的结果是产生
重叠延伸拼接
嵌合的 DNA分子(chimericDNA),因此形成了重组
SOE技术由 HortonRM和 HoSN(1989)创建,主要
PCR的概念,并用于人为制造重组体的实验中。
应用于制备嵌合分子或完整 cDNA、框内删除和插入片
重组 PCR策略大致可以分为三类:重叠延伸拼接
段以及定点突变。其发展方向集中于三方面:(1)简化
(splicingbyoverlapextension, SOE)、跳跃 PCR
拼接过程:采用一对反向克隆载体和通用引物扩增的
(jumpingPCR,JPCR)和 DNA重排(DNAshuffling)。
一步拼接法(one?stepoverlapextensionPCR,OOE?
SOE通过重叠延伸引物(上游片段的 3′端碱基序列和
PCR)以及应用大量重叠引物组装完整基因等方法都
下游片段 5′端碱基序列的共线化形式)人为地在不同
为实现单管拼接反应积累了经验[1,2]。(2)组件长度两
的靶基因片段上引入重叠互补区,引导这些片段顺序
极化:限制性内切酶介导的 DNA重组受制于靶片段上
连接。JPCR策略的关键是产生中止于序列同源区的
一系列不完全延伸的片段,这些片段以其同源的 3′尾的酶切位点分布状况,所以这种方法对短于 100bp和
巴退火至另一基因片段上的同源区