文档介绍：实验十七谷丙转氨酶活性测定 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase
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一、实验原理
氨基移换酶也称转氨酶,为广泛存在于生物机体内的酶,其作用为催化α-氨基酸的α- 氨基与α- ***酸的α- ***基互换。因此在氨基酸的合成和分解,尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的种类甚多。任何一种氨基酸进行转氨作用时,都由其专一的转氨酶催化,。
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在各种转氨酶中,谷氨酸-草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)及谷氨酸-***酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)活力最强。
上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内,在正常人血清中也有少量,机体发生肝炎。心肌梗塞等病变时,血清中转氨酶活力显著增加,所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。它们的催化反应如下:
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COOH COOH COOH COOH
CHNH2+ C=O C=O + CHNH2
CH3 (CH2)2 CH3 (CH2)2
COOH COOH
转氨酶←→
丙氨酸α-***戊二酸***酸谷氨酸
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→
测定转氨酶活力的方法很多,如分光光度法,纸上层析法等。在本方法中,谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α-***戊二酸后,生成的***酸与2,4- 二硝基苯肼作用生成***酸2,4- 二硝基苯腙。
本方法中用分光光度法,根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力。
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二、实验用品
1、材料
新鲜动物肝匀浆。
2、试剂
(1)(pH=)
KH2PO4液50ml, ,,混匀即得。
(2)***酸钠标准液():
取A·R***酸钠11mg溶解于50ml (宜当日新配)。
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(3)谷丙转氨酶底物:
取分析纯α-***,DL—,加1N NaOH约10ml至完全溶解。用1N NaOH或1N HCl校正其pH=,,然后加***仿数滴防腐,在冰箱内可保存一周。- ***,丙氨酸200微克分子。
(4)2,4—二硝基苯肼溶液:
将A·R纯2,4—,加100ml 1N HCl液。2,4—二硝基苯肼溶解较慢,把锥形瓶放在暗处不时摇动,全部溶解后,滤入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。
(5)。
3、仪器设备
试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计
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三、方法和步骤
1、肝匀浆制备:
取新鲜动物肝脏,用生理盐水冲洗,滤纸吸干,,剪成小块,置于玻璃匀浆管内, mol/L磷酸缓冲液,制成10%肝匀浆,冰冻保存。
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2、标准曲线的绘制
取6支试管分别用0、1、2、3、5标号,按下表所列次序添加各试剂。
将试管于37℃水浴中保温,平衡管内外温度,
2,4—二硝基苯肼后再保温20分钟,
NaOH 5毫升,
在室温下静置30分钟后,
以0号管做“空白”用520nm进行比色,读出光吸收值,以***酸的微摩数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线。
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管号
试剂
0
1
2
3
4
5
***酸钠标准液/ml
谷丙转氨酶底物/ml
磷酸缓冲溶液
( ) /ml
37℃水浴中保温,
平衡管
内外温
度
2,4-二硝基苯肼/ ml
保温20
分钟
NaOH ()/ml
5
5
5
5
5
5
静置30
分钟
A520nm
表1.***酸钠标准曲线的绘制
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