文档介绍：基因组表达测序数据分析
1991年Adams开创了EST测序,对每个转录本测定400-500bp 的标签序列,一般每个cDNA文库测序通量为数万个EST。至今,EST数据已经成为数量最多,涉及物种最广的转录组数据。NCBI设立了专门的数据库dbEST来存放这些数据。
1995年Velculescu建立了短标签来标识法SAGE测序方法,利用转录本3’端第一个CATG位点下游14p长的短标签来标识相应的转录本。SAGE方法相比EST测序在通量上有了很大提高,一个SAGE文库通常能够测序几十万个短标签,使得转录组测序通量大大提高。但是由于SAGE标签仅14bp,很难唯一注释到相应转录本,大量实验得到的SAGE标签无法定位到基因。
之后Saha提出了LongSAGE方法,将SAGE标签长度增加到21bp,使得直接基因组注释成为可能。
衍生了一系列基于21bp标签的测序方法,如CAGE,MPSS,PET等,但是21bp的短标签注释仍然存在很多问题,目前实验得到的标签约有一半无法注释到基因组。
RNA-Seq
样品检测
文库制备
Cluster Station
Illumina Sequencing
生物信息分析
Total RNA样品检测
Agilent 2100 检测
OD260/280:~
RNA 28S:18S ≥ ; RIN≥7
检测报告-合格样品
消化DNA
mRNA的分离
mRNA的打断
cDNA的合成
↓
↓
末端修复
↓
↓
加接头
胶回收
3’端加A
PCR
PCR胶回收
↓
↓
文库制备
↓
↓
真核mRNA的纯化
mRNA的纯化主要通过磁珠吸附原理从而分离纯化
Oligo(dT)25磁珠纯化原理主要是mRNA的3′的poly A与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC(磁分离器)从溶液中分离出来。
mRNA与磁珠结合后,再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。
mRNA反转录
纯化过的mRNA样品加入1 µl的fragment buffer 70℃。
加入1µl的stop buffer终止反应。
加入沉淀剂(NaAc 糖原无水乙醇)沉淀酶切产物。
末端修复
cDNA 3′末端加A
Adapter连接