文档介绍：根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化
学生:贾俊忠
学号:2007103070

农杆菌细胞呈杆状,以1-4根周生鞭毛进行运动。农杆菌侵染时,细菌通过原有的病斑或伤口进入宿主组织,但细菌本身不进入宿主植物细胞,只是把Ti质粒的DNA片段导入植物细胞的基因组中;
根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中,对单子叶植物不很敏感。
根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理
损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
这些化学诱导物通过农杆菌的细胞膜,活化virA和virG基因,再诱导vir区的其他基因;
vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移;
T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上;
T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;
农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源;
冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti 质粒的接合转移,扩大侵染范围。
根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源基因在植物细胞中得到表达,致使植物细胞转化为肿瘤状态,并大量合成冠瘿碱。这些冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源,有利于农杆菌的繁殖和Ti质粒的转移,进一步扩大侵染领域。
根癌农杆菌的制备
农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用。
农杆菌的培养:
1)培养基:目前常用的农杆菌培养基有LB、YEB、YEM、TY、PA、523等,其中LB、YEB、YEM、523属富集培养基,是常用的制备工程菌液的培养基;PA和TY是常用的农杆菌选择培养时的培养基。
2)农杆菌的生长条件:农杆菌培养分为固体平板培养和液体振荡培养,固体培养一般需2-3天,液体培养一般需1-2天,25-30度;当细菌增长达对数生长期,可以稀释培养或储存于4度冰箱;用光密度测定法测定农杆菌浓度。
Vir区基因活化诱导物的使用
Vir区基因的活化直接调控着T-DNA的转移,酚类化合物对vir区基因的活化具有重要作用,常用的诱导物是乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮;
诱导物的采用三种方法:1)在农杆菌液体培养基时加AS,加入时间在制备工程菌侵染液前4-6小时加入;2)AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基中;3)在农杆菌液体培养基中和共培养基中都加入AS。
-,vir区基因的诱导达最高水平。
外植体的选择
通过对不同外植体转化成功的实例分析,叶片(叶柄)为35%、子叶为9%、胚轴为10%、茎为17%。
转化外植体的选择原则:
1)以叶片、子叶、胚轴为首选材料;
2)要注意外植体年龄,选择幼年的外植体;
3)以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外植体应考虑其转化的最佳感受期;
4)应考虑感受太细胞在外植体的部位。