文档介绍：根癌农杆菌T质敉介导基因转化
学生:贾俊忠
学号:2019103070
根癌农杆菌的生物学特性
·农杆菌细胞呈杆状。以1-4根周生鞭毛进行
运动。农杄菌侵染时,细菌通过原有的病斑
或伤口进入宿主组织,但细菌本身不进入宿
主植物细胞,只是把∏质粒的DNA片段导入
植物细胞的基因组中;
根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中,对单
子叶植物不很敏感。
根癌衣杆菌的遗传宿主及内共生原理
损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杄菌的侵染信号
这些化学诱导物通过农杄菌的细胞膜,活化virA和
VirG基因,再诱导Vir区的其他基因
vir基因的活化,作用于TDNA的加工及TDNA的转移
TDNA进入植物细胞后整合到核DNA上
T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素;
农杆菌∏i质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因,分解
细胞产生的冠瘿碱作为唯一的碳源和氮源;
瘿确促进农杆菌的附着及激活tra基因有利于Ti
合转移,扩大侵染范围。
根癌农杆菌通过基因转化把T-DNA上的基因
导入植物细胞并整合到核DNA上。这些外源
基因在植物细胞中得到表达,致使植物细胞
转化为肿瘤状态,并大量合成冠瘿碱。这些
冠瘿碱又是农杆菌的唯一碳源,有利于农杆
菌的繁殖和∏i质粒的转移,进一步扩大侵染
领域
农杆菌
植物细胞产生的诱导物
转化积整合
基因超量诱导
过
川激图分裂
农杆菌与植物细胞的化学分子内共生关系
二、根癌取杆菌转化程序及操作原理
农杆菌基因转化可分为三部分:
°受体系统的建立;
们i质粒转化载体的构建;
目的基因的转化。
外植体一
农杆菌
继代打
伤组织
除先))
体细胚
芽分化培养
抗性无根试管苗
21-5农杆菌T质粒介导基因转化程序
根癌取杆菌的制备
·农杆菌的培养、生长状态及纯度对转化具有重要作用
农杆菌的培养
1)培养基:目前常用的农杆菌培养基有LB、YEB、
YEM、TY、PA、523等,其中LB、YEB、YEM、523属富
集培养基,是常用的制备工程菌液的培养基:PA和TY
是常用的农杄菌选择培养时的培养基。
农杆菌的生长条件:农杆菌培养分为回体平板
体振荡培养,國体培养一般卿2一3天,液体
需1-2天,25-30度:当细菌增长达对数生
以稀释培养或储存于4度冰箱;用光密度测
法测定农杆菌浓度。
Vi区基因活化诱导物的使用
Vir区基因的活化直接调控着TDNA的转移,酚类化
合物对vir区基因的活化具有重要作用,常用的诱
导物是乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮
诱导物的采用三种方法:1)在农杆菌液体培养基
-6小旳
加入;2)AS加在农杆菌和外植体共培养的培养基
中;3)在农杆菌液体培养基中和共培养基中都加
-,vir区基因的诱导
水平。
略外植体的选择
·通过对不同外植体转化成功的实例分析
叶片(叶柄)为35%、子叶为9%、胚轴
为10%、茎为17%
转化外植体的选择原则
1)以叶片、子叶、胚轴为首选材料;
2)要注意外植体年龄,选择幼年的外
植体;
3)以幼胚、体细胞胚及成熟胚作为外
植体应考虑其转化的最佳感受期
4)应考虑感受太细胞在外植体的部位