文档介绍：第一节根癌农杆菌 Ti质粒基因转化载体的构建? Ti质粒的发现历史? 1974 年 zeazen 等从根癌农杆菌中分离出一巨大质粒,称为致癌质粒( Tumor inducing plasmid ),简称 Ti质粒. ?最初的发现和命名是 1907 年,Smith 和 Townsent 发现双子叶植物常发生的冠瘿瘤是由根癌农杆菌( Agrobacterium tumefaciens )诱发形成的. Ti质粒的遗传特性及类型 Ti质粒为染色体外遗传物质,为双股共价闭合的环状 DNA 分子,其分子量为 × 10 7~ × 10 8,大小为 180 ~ 250kb 。迄今人们已从多种植物中分离出了不同种类的农杆菌,它们的 Ti质粒结构特性均有差别。根据 Ti质粒诱导合成的冠瘿碱(opine) 种类不同, Ti质粒可被分为四种类型:章鱼碱型(octopine) 、胭脂碱型(nopaline) 、农杆碱型(agropine) 、农杆菌素碱型(agrocinopine) 或称琥珀碱型(inamopine) 。其中,章鱼碱型和胭脂碱型 Ti质粒较为常见。 Ti质粒的基因位点及其功能区域? Ti质粒结构示意图(左)及乙酰丁香酮及其衍生物的结构示意图(右) (1) T-DNA 区( transferred-DNA regions ) : T-DNA 是农杆菌侵染植物细胞时,从 Ti 质粒上脱离下来转移并整合到植物的核基因组上的一段 DNA 。 T-DNA 片段上的基因与肿瘤形成有关。(2) Vir 区( virulence region ):该区段上的基因的产物为 T-DNA 的转移及整合所必需,它导致农杆菌产生毒性,故称之为毒区。在 Vir 区有 VirA 、 VirB 、 VirC 、 Vir D 、 VirE 、 VirG 、 VirH7 个操纵子共 24 个基因。(3) Con 区( regions encoding conjugations ): 该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因( tra ), 调控 Ti 质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活 tra 基因,诱导 Ti 质粒转移,故称为结合转移编码区。(4) Ori 区( origin of replication ):该区段基因调控 Ti质粒的自我复制,故称为复制起始区(点)。 LB RB Ti质粒介导基因转化的原理? 1. 植物受伤后会在伤口分泌出一些酚类物质( 如乙酰丁香酮、α-羟基乙酰丁香酮等)。? 2. 酚类物质诱导 Ti 质粒上毒性基因(vir) 表达: 当根癌农杆菌接触到植物表面的受伤部位后,这些酚类小分子化合物诱导信号经 VIR A 蛋白传递给 VIR G , VIR G 激活其它 vir 基因( virB 、 virC 、 vir D 、 virE ) 表达 Ti质粒上毒性基因(vir) 表达。? 3. T-DNA 单链分子释放: virD 基因编码一种核酸内切酶,先在 T-DNA 右边缘区(RB) 切开一个单链缺口,再在同一链左边缘区(LB) 切开另一个单链缺口,使 T-DNA 以单链形式释放出来。? 4. T-DNA 单链分子转移到寄主细胞: T-DNA 单链分子与 vir 产物 VIR D2 蛋白共价结合,并在 VIR D4 和 VIR B 蛋白的帮助引导下穿过根癌农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、以及植物的细胞壁、细胞膜和核膜。 Ti质粒介导基因转化的原理? 5. T-DNA 整合到植物细胞的染色体中。 T-DNA 单链分子进入植物细胞后,在植物有关酶体系的催化下,互补的双链 T- DNA 分子,在 RB 序列的引导下, T-DNA 分子整合到植物细胞的染色体中。? 6. T-DNA 区域中的生长素和细胞分裂素基因过量表达导致细胞大量增值,形成冠瘿瘤,随着转化细胞的增值, T-DNA 也被大量扩增,冠瘿碱合成基因的拷贝也随之增加,这些基因表达后催化合成冠瘿碱,为农杆菌的生长提供碳源和氮源。信号受体( VIR A ) 酚类物质诱导信号 VIR G RB LB转移到寄主细胞整合到植物染色体中 T-DNA 单链分子释放 VIR G 激活 virB 、 virC 、 virD 、 virE 、 virH 表达 VIR D 植物伤口诱导信号信号传递诱导表达 VIR D 2、 VIR D 4、 VIR B 、 VIR E 2等土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制酚类物质 VIR A 由此可见,农杆菌对植物的侵染作用,就是一种天然发生的基因工程。一、 Ti质粒的改造(一)Ti 质粒 ,为双股共价闭合的环状 DNA 大分子,其大小为 180-240 kb 。 根据冠瘿碱的种