基因操作主要技术原理.doc

文档介绍：基因操作的主要技术原理
1. 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
    将某种分子放到特定的电场中,它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成正比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。
    在生理条件下,核酸分子中的磷酸基团是离子化的,所以,DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、RNA放到电场中,它就会由负极→正极移动。
 
   在凝胶电泳中,一般加入溴化乙锭(EB)--ethidium bromide染色,此时,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
   DNA的脉冲电泳技术:PFGE-Pulse-field gel electrophoresis
2. 核酸的分子杂交技术
    在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子,都是在杂交之前,通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、***纤维素滤膜,叠氮苯氧***纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAE)等。
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤:
   将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting);
   将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3. 细菌的转化
    所谓细菌转化,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株,而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前,必须预先用CaCl
2处理大肠杆菌细胞,petent Cells)。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用,质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
    对绝大多数hsdR-,hsdM-突变体菌株(k12),每ug DNA可得107-108个转化子。
4. DNA序列分析
a. Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列,其基本原理如下:
①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板,合成准确的DNA互补链;②该酶能够用2',3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端,从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中,加入模板DNA,引物(特异性引物,如T7,T3,M13等),DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段,无5'→3'外切酶活性。
b. Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)
    该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DN***段,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,可直接读出待测DN***段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中,只有1-2种发生特异性的化学切割反应:
碱基的特异性修饰;
被修饰的碱基从核糖环上转移;
失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。
专门用来对核苷酸作化学修饰,并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。 
    硫酸二甲酯是碱性化学试剂,能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生***化,在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解,并引起DNA链的断裂。在碱性条件下,肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl,那么,只有C被特异性切割。
       
         
c. DNA序列分析自动化
    用四***若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物,带有这种引物的DN***段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应,跑DNA凝胶后用计算机检测。
(SBH-Sequencing by hybridization)
    如果一段较短的DNA探针能与较长的DN***段杂交,并形成完全的双链结构,我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列,这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DN