文档介绍：(Agarose&Polyacrylamide)将某种分子放到特定的电场屮,它就会以一定的速度向适半的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率,它与电场强度成正比,与该分子所携带的净电荷数成止比,而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。在生理条件下,核酸分子屮的磷酸基团是离子化的,所以,DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态(Polyanions)。将DNA、R\A放到电场屮,它就会由负极一正极移动。Agarose的分离范围在50bp—数十kb(%) (%)Polyacrylamide(PAGE),1 lOOObp(20%) (4%)»2-1琼脂糖及聚丙烯酰***授胶分辨DN***段的能力凝胶类型及浓度分离DN***段的大小范围(bp)%琼脂糖50000—%琼脂糖20000〜%琼脂糖6000〜%聚丙烯酰***1000〜%聚丙烯酰***500〜%豪丙烯酰***50-1在凝胶电泳中,一般加入渙化乙锭(EB)--ethidiumbromide染色,此时,核酸分子在紫外光下发出荧光,肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。DNA的脉冲电泳技术:PFGE-Pulse-,经过凝胶电泳分离的DNA或RYA分子,都是在杂交之前,通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶屮的位置原封不动地〃吸印〃转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、***纤维素滤膜,叠氮苯氧***纤维素滤纸(DBM)和二乙氨基乙基纤维素滤膜(DEAR)等。核酸分子杂交实验包括如下两个步骤:将核酸样品转移到固体支持物滤膜上,这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移,主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting);将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有吋也称这类核酸杂交为卬迹杂交。dnawurwxjt***眛阳性初顾点的X光矗片 ADNAtPii的咖Color-orfluorescence・producingsubstrate图2-・,是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DXA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株,而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNAZ前,必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞,petentCells)。Mg'对维持外源DNA的稳定性起重要作用,质粒DNA111的抗生素是筛选标记。对绝大多数hsdR-,hsdM-突变体菌株(kl2),每ugDNA可得107-108个转化子。,其基本原理如下:①DM\聚合酶能够用单链DM\作为模板,合成准确的DNA互补链;②该酶能够用2',3'--双脱氧核昔三磷酸作底物并将英聚合到新生寡核苛酸链的3'-末端,从而终止其延伸反应。在DNA测序反应屮,加入模板DNA,引物(特异性引物,如T7,T3,M13等),DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC和一种ddNTPo常用KIenow大片段,无5'->3'外切酶活性。ddNTPOH/OH0ACG或TA•N电4ARDNAM*dATPOOTPdCTPdTTP♦I序Eta的网血an』弘屯"(1脫・《|绮止oka序男分虧肚aua )•伶議“斜・《!HNACTGACTTCGACAATQTTII4记釣引♦ddATPctqacttcgacaaMGY丄」&C8ACAMaxam-G订bert化学修饰法(哈佛大学)该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DN***段,造成碱基的特界性切割并产生一•纽具有不同长度的DXA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,可直接读出待测DN***段的核昔酸序列。该反应的关键在于使DNA的4种核背酸屮,只有1-2种发生特异性的化学切割反应:碱基的特异性修饰;被修饰的碱基从核糖环上转移;失去碱基的糖环部位发牛DXA链断裂。专门用來对核昔酸作化学修饰,并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)