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【摘要】 目的: 观察pUDKH(携带肝细胞生长因子基因的质粒)基因治疗犬下肢缺血后对其血管和肌肉组织病理学的影响. 方法: 杂种犬在静脉内注射苯巴比妥钠麻醉下，于左后侧腹股沟在股动脉由髂外动脉分支处的起始端进行全结扎，造成肢体缺血模型. 模型犬被随机分为对照组和pUDKH处理组，并在结扎后即刻分别注射pUDK或pUDKH. 于手术后3 mo，行左髂外动脉造影术，测定股动脉血流量和下肢远端局部温度，并从被结扎的后肢股动脉及内外侧肌肉取组织标本，经常规组织病理切片染色，光学显微镜下观察. 结果: 3 mo时血管造影pUDKH组可见明显血管网的形成，而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管；此时转移pUDKH组犬股动脉血流量已恢复到结扎前的水平，而对照组股动脉血流量仅为结扎前的1/5~1/3；转移pUDKH组结扎侧肌肉温度与健侧相比无明显差异，而对照组两肢体肌肉温度却相差1~2℃. 组织学观察对照犬可见结扎点远端股动脉塌陷，肌束间动脉管壁变厚，管腔变小甚至消失，少见新生的小血管；pUDKH处理组犬结扎点远端股动脉管腔开放，肌束间小动脉壁均普遍未见增厚，管腔亦未缩小；对照犬结扎侧肌纤维变性、断裂、肌束内水肿、脂肪性变，pUDKH处理组结扎侧的肌肉组织中上述病变不明显. 结论： pUDKH的局部注射对犬下肢缺血后血管和肌肉具有保护作用.
【关键词】 pUDKH基因；血管；肌肉；组织病理
0引言
下肢缺血主要是血栓闭塞性脉管炎或糖尿病性下肢中小血管病变、周围神经病变等所造成的下肢慢性缺血，涉及血管、神经、肌肉等组织的病变，当病变进展而减少了动脉的横截面积至80%或
材料
动物：河北地区草狗18只，雄性，年龄为~3岁，体质量12~15 kg，由军事医学科学院动物实验中心提供. pUDKH: 携带人肝细胞生长因子基因的重组裸质粒, pUDK: 未携带人肝细胞生长因子基因的空质粒, 军事医学科学院放射医学研究所三室提供.
方法
动物模型的建立犬经15 g/L戊巴比妥钠静脉麻醉后. 在无菌条件下分离左侧髂外动脉远端及分支和股动脉近端，将髂外动脉远端及股动脉分支全部结扎，造成左下肢血管完全闭塞性血管病模型. 在股动脉处安置血流量计探头，左外侧肌肉插入THRNST针型体温度电极，测定股动脉完全闭塞前、后10 min内股动脉血流量及左、右外侧肌肉温度，以判断左侧髂外动脉远端已完全闭塞. 右侧下肢动脉不予结扎.
基因转移将模型动物随机分为4组：模型对照组,pUDKH mg/kg组(4只),pUDKH mg/kg组(4只)和pUDKH mg/kg组(4只). 按每公斤体质量给犬的药量，将pUDK或pUDKH稀释在1 mL生理盐水中，于手术后10 min内，在左大腿肌内侧注射3点，左大腿肌外侧注射2点，每点注射体积为 mL，最后逐层关闭伤口. 以后的饲养过程中不再进行基因转移.
动脉血管造影每组全部犬的术后90 d，于右侧股动脉内插管行至髂总动脉端，行左髂外动脉造影术，导管尾端连接一高压注射器快速注入泛影葡胺，拍摄X光片以观察新生血管和侧支循环的形成情况.
股动脉血流量及肢体温度测定在术前和术后0 d，90 d各测定股动脉血流量和下肢远端局部温度一次.
组织病理学检查于手术转基因后3 mo，从结扎的后肢股动脉及内与外侧肌肉取组织标本，经常规组织病理切片染色，光学显微镜下观察.
统计学处理： 实验数据采用SPSS 软件分析. 实验数据以x±s表示，用方差分析法及LSDt检验比较各给药组与对照组的差异，组内左、右比较采用配对t检验. 为有统计学意义.
2结果
血管
转移质粒pUDKH可明显促进缺血肢体血管网的建立股动脉完全结扎后，转移质粒pUDKH组于结扎后即刻进行血管造影便可见到血流完全阻断，90 d时有明显的新生血管和血管网形成. 这些新生血管和血管网形成后，从股动脉结扎点到股动脉远端由许多小血管网连接，从而使髂外动脉灌注到结扎点远端股动脉血流运行通畅. 单纯转移空质粒
A： pUDKH组，转移pUDKH mg/kg后第90日；B： 对照组，转移空质粒pUDK mg/kg后第90日, 箭头所示为结扎部位.
(pUDK)的对照组,90 d的新生血管数显着少于转移pUDKH基因组，股动脉结扎点以下的动脉全部消失(图1B). 转移pUDKH ，， mg/kg三个剂量组之间差别不明显， mg/kg组比其他2个给药组更容易使髂外动脉结扎点到股动脉接点缩短.
转染pUDKH的三个剂量组在/100 cm2骨骼肌内、外侧和皮肤中血管数明显比模型对照组多，差别非常明显. 与未手术的右下肢骨骼肌内、外侧和皮肤比较，无明显的差异. 转pUDKH基因大、中、小剂量组犬骨骼肌组织之间的血管数与健康肢骨骼肌组织血管数相差不明显(表1).表1左下肢内、外侧骨骼肌和皮肤血管数的变化(略)
股动脉血流量及肢体温度测定髂外动脉完全结扎后即刻，股动脉血流量从平均(±) mL/min，下降为0，随着术后饲养时间的延长，模型对照组下肢股动脉血流有所增加，术后90 d比术后即刻增加了7 mL/min. 而转染pUDKH的3个剂量组在术后90 d，结扎侧股动脉流量已经恢复到术前的水平(表2).表2转染pUDKH后股动脉血流量的变化
转染pUDKH后90 d犬左侧下肢肌肉温度与健侧肌肉温度无明显差异，而模型对照组左右后肢肌肉温度相差1~2℃(表3).表3转染pUDKH后左侧肢体温度的变化(略)
股动脉形态对照犬有的股动脉仍处于塌陷状态，致使管腔几乎完全消失；pUDKH 处理犬股动脉的横截面上可见内弹力板完整，有的管腔已伸展完全，可与正常犬者相当.
肌束间血管形态对照犬肌束间小动脉管壁变厚、管腔变小甚至消失，且肌束间或肌外衣下纤维组织中也罕见新生的小血管. 中等大小动脉管腔亦变小、管壁变厚. pUDKH处理犬除个别者外，肌束间小动脉壁均普遍未见增厚，管腔亦未缩小. 此外，肌束间或肌外膜下的结缔组织中常含有较多的新鲜红细胞.
肌肉形态对照犬观察到结扎侧肌纤维变性、横纹不清晰；肌纤维及细胞核变细、断裂、染色淡，肌束内水肿，以及出现脂肪. pUDKH处理犬经各剂量处理的结扎侧的肌肉组织中上述病变均已不很明显.
3讨论
在实验中，经活体股动脉血管造影已清楚地观察到,pUDKH处理组犬使结扎侧肢体比用不携带HGFA： 对照组，转移空质粒pUDK后第90日,示肌束内及肌束间中小动脉管壁变厚，管腔变小,甚至几尽消失; B：pUDKH组，转移pUDKH后第90日，示肌束间中小动脉管壁未见增厚，管壁无缩小，管腔内充满新鲜的红细胞.
基因的空质粒处理的对照组犬的相应肢体中，更早而
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