文档介绍：重组DNA技术binant DNA technology
邓益斌
主要内容
掌握重组DNA技术的定义
掌握限制性核酸内切酶的概念
熟悉常用工具酶的种类及用途
熟悉重组DNA技术的基本步骤
第一节重组DNA技术的定义及步骤
基因重组技术:在体外对不同来源的DNA分子进行共价连接形成重组DNA ,再将重组子导入受体细胞,扩增、繁殖和表达。
基本步骤
2. 将目的基因与运载体DNA在体外进行重组
目的基因
运载体
DNA
限制性核酸内切酶
DNA 重组体
引入宿主细胞
筛选出含有
重组体的细胞
无性繁殖扩增、表达基因产物
3. 转化或转染
4. 筛选
5. 克隆(cloning)基因的表达、检测、分离
1. 目的基因获得
一、限制性核酸内切酶
选用II型限制酶,能专一识别和切割双链DNA
限制酶的命名 Haemophilus influenzae Rd
嗜血杆菌属流感杆菌(种名) 株名
取H 取in d
Hind I
第二节重要的工具酶
若该微生物有不同的变种和品系,再加上该变种和品系的第一个字母,需大写;从同一种微生物中发现多种限制酶,依据发现的前后顺序用罗马数字表示:例如从淀粉液化芽孢杆菌(Bacills amyloliquefaciens) H株分离的第一种限制型内切酶,命名为 BamH I
II型限制内切酶切割双链DNA产生三种不同的切口
(1)产生平末端:
5’A G C T 3’ Alu I 5‘A G C T 3’
3’ T C G A 5‘ 3’ T C G A 5‘
(2)产生5’端突出的粘性末端
5’ 3’ BamH I 5’G 3’
TAGG 5’ TAG G 5’
(3)产生3’端突出的粘性末端
5’GAGCTC 3’ SaC I 5’G GAGCT C 3’
3’CTCGAG 5’ 3’ C TCGAG 5’
二、DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大肠杆菌DNA聚合酶I分子量109kD,它具有三种酶活性。 Klenow片段分子量76kD,
它具有二种酶活性(去除5’ 3’外切酶活性)。
2. Taq DNA聚合酶: 耐热(75-80℃),分子量65kD,也具5’ 3’外切酶活性。
反转录酶(RDDP):多功能酶,无3’ 5’DNA外切酶活性,具有3’ 5’RNA外切酶活性。
4. 末端脱氧核糖核酸转移酶: 60kD (3’羟基端)
三、DNA连接酶:
1. T4噬菌体DNA连接酶:两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端(Km=µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。
2. 大肠杆菌DNA连接酶
四、T4多核苷酸激酶:催化将ATP的γ-磷酸转移到DNA链5’末端
五、碱性磷酸酶:催化切除DNA、RNA、dNTP上5’磷酸基团
重组
5’— A
3’— TTCGA—
AGCTT—3’ A—5’
目的基因粘性末端
运载体DNA粘性末端
5’—AAGCTT—3’—TTCGAA—
DNA连接酶
退火
末端转移酶
粘端连接
平端连接
dTTP
末端转移酶
dATP
退火
DNA连接酶
第一部分获得目的基因