文档介绍：细胞转染技术
汇报人:宋晓萍
目录
基本原理
1
质粒提取扩增
2
3
4
常见问题及解决方案
5
影响转染实验的因素
转染方法
基本原理
1
将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。
细胞转染——
研究内容:研究和控制真核细胞基因功能
应     用:基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验
常规转染技术
瞬时转染
外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小,大约 1/104 转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素 B 磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
稳定转染
外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒 DNA 转染效率较高,在转染后 24-72 小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果, 常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。
脂质体介导转染
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理,先形成脂质体-DNA复合物,散布在细胞周围,然后通过细胞的内吞作用,将目的基因导入细胞内。
1.  promega公司
 
Promega转染试剂产品适合于人HeLa,Hep G2,293,K562,Jurkat;猴COS-7,CV-1;小鼠NIH3T3;仓鼠BHK,CHO;大鼠PC12;昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。
 
2.  Invitrogen公司
 
Lipofetamine2000,适合于Hela,BHK,HEK,COS-7,PC12,NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。
 
3.  转染FAQs:
转染试剂的选择
脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍,所以,脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
悬浮细胞是用的电穿孔法。
细菌铺板:加入抗生素(终浓度是50ug/ml-100ug/ml)
挑选菌落:从LB培养基上挑选菌落备用
细菌培养:37摄氏度培养箱中以180rpm摇动12~14h,使大肠杆菌繁殖
碱裂解抽提:采用细胞裂解的方式,从含目标质粒的大肠杆菌菌液中将质粒提取出来
2、质粒的提取扩增
质粒的转化具体方法省略……
NOTE:
不同的感受态细菌转化效率不同,
DNA就可使50ul的感受态细胞饱和,DNA量过多会降低转化效率。
转化时为提高转化效率,。