文档介绍：枸杞多糖的提取与鉴定
1242818杨立君
实验原理
强酸可以使糖类脱水生成糠醛。生成的糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮脱水缩合,形成糠醛的衍生物,呈蓝绿色。颜色的深浅可以作为定量的标准。这一方法具有很高的灵敏度,糖含量在30μg左右就能进行测定,所以可以作为微量测糖之用。一般样品少的情况下,采用这一方法比较合适。
实验试剂
:将葡萄糖105℃烘干至恒重(2h),准确称取50mg,无离子水定容至500mL,.
-浓硫酸试剂:,溶于100mL浓硫酸,现用现配。
,阿拉伯糖,甘露糖
,活性炭,正丁醇,无水乙醇,丙酮。三氯甲烷,甲苯胺乙醇溶液
实验器材
分光光度计,超速离心机,电炉,烧杯,试管,干燥器,滤纸,层析缸以及其他相关玻璃仪器
实验流程
(一) 提取
枸杞干果粉碎,氯仿- 甲醇(2∶1)回流脱脂8~10 h 近无色,挥干溶剂以后将脱脂后的枸杞样品放入烧杯中,分3次加15、12、10 倍量的蒸馏水于90 ℃水浴提取,每次2 h;收集3 次的滤液减压浓缩至约200 mL,转移到大烧杯中,加4 倍量的95%乙醇,沉淀12 h 后抽滤,并依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤,干燥后便得到枸杞多糖的粗制品。
(二)纯化
多糖粗品加水溶解,4 000 r/min 离心10 min 后取上清液,加30%双氧水适量,40 ℃保温4~6 h 后,加三氯甲烷-正丁醇(4∶1,Sevag 法)溶液沉淀蛋白,取上清液;此步骤反复多次,直到无白色絮状沉淀出现。将除去蛋白的多糖溶液浓缩后,转移到分子排阻为8 000~10 000 Da 的透析袋中,流水透析24 h 后,蒸馏水透析过夜,溶液颜色变淡,浓缩后
真空干燥得枸杞多糖精制品。
(三) 理化性质分析
将枸杞多糖精品分别加入水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和正丁醇中,观察其溶解性。另在浓硫酸存在下观察枸杞多糖与α-萘酚的作用,于界面处观察颜色变化。
(四)蒽酮比色法测定含量
制备标准曲线:取六只试管,如下表进行操作:
管号
步骤
0
1
2
3
4
5
标准溶液,ml
0
蒸馏水,ml
1
置冰浴5min
蒽酮试剂,ml
4
4
4
4
4
4
沸水浴中准确煮沸10min,自来水冷却,室温放置10min后,比色
A620
2. 样品含量测定
吸取1ml多糖溶液置试管中,浸于冰浴中冷却,再加入4ml蒽酮试剂,沸水浴中煮沸10min,取出后自来水冷却,620nm比色,其他条件与做标准曲线相同。测得吸光度值由标准曲线查处出样品液的糖含量。(如果样品管的吸光度值超出标准曲线范围,需将样品进行适当的稀释,再取1mL进行鉴定)。
3,计算
根据所测的吸光度平均值,根据标准曲线,求得糖含量(微克),记为
式中表示1mL样品测定液的多糖含量(μg);表示多糖提取液的体积(mL);n表示测定液的稀释倍数;m表示枸杞的质量。
(五) 枸杞多糖及单糖鉴定纸层析
1. 以正丙醇-浓氨水-水为展开剂,分别将枸杞多糖粗品和精品溶于水中,点样于层析滤纸上,展层后吹干,以甲苯