文档介绍：1、研究背景
RNA研究的重要性
DNA,RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子,是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状,而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA,rRNA和tRNA,同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。
RNA分布
不同丰度
组织名称
样品量
总RNA含量
高丰度
肝脏
1mg
2-4μg
脾脏
1mg
心脏
1mg
中丰度
大脑
1mg
-2μg
胚胎
1mg
肾脏
1mg
肺
1mg
低丰度
膀胱
1mg
0-
骨
1mg
脂肪
1mg
高丰度
成纤细胞
105
-1μg
人白细胞
105
中丰度
酵母
105
-
拟南芥叶片
1mg
-
低丰度
烟草叶片
1mg
-
玉米叶片
1mg
2、方法及原理
RNA的提取流程
1、样本前处理
2、细胞裂解
3、 RNA的纯化及获得
RNA提取流程-- 样品前处理注意点
选择新鲜血液,不得超过4小时
选择新鲜的幼嫩组织
选择处于生长旺盛的时期收集细胞
选择新鲜组织,生长旺盛的组织
可将新鲜血液先进行红细胞裂解,得到的白细胞
然后加入一定量的TRNzol,-70℃保存较长时间
去掉培养基,加入一定量TRNzol
-70 ℃保存较长时间
推荐使用专门的RNA样品
储存液进行储存
液氮或加入RNase抑制剂中保存,
避免反复冻融
RNA提取流程-- 样品前处理中如何保存样本
RNA提取流程--细胞裂解,以释放RNA
异硫***酸胍/酚-TRNzol总RNA提取试剂
独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂
胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒
RNA提取流程-- RNA的纯化及获得
RNA纯化要求
1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质
2 排除有机溶剂和金属离子的污染
3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度
4 排除DNA分子的污染
RNA提取的注意事项
杜绝外源酶的污染
一:严格戴好口罩,手套。
二:实验所涉及的离心管,Tip 头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。
三:实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保 RNase-Free。
阻止内源酶的活性
一:选择合适的匀浆方法。
二:选择合适的裂解液。
三:控制好样品的起始量。
Rnase 污染的10大来源
1:手指头
2:枪头
3:水/缓冲液
4:实验台面
5:内源 Rnase
6:RNA 样品
7:质粒抽提
8:RNA 保存
9:阳离子(Ca, Mg)
10:后续实验所用的酶