文档介绍：实验六:淋巴细胞体外增殖活化和功能检测
实验者:毛寰宇(**********) 实验时间:2015年4月22日合作者:周鹏、张国栋
实验原理
:细胞在体外培养过程中,如受到一定物质的刺激,可转化为淋巴母细胞,表现为代谢旺盛,蛋白质和核酸合成增加,并产生一系列形态变化如:细胞变大成簇、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等。刺激T淋巴细胞增殖的物质包括:非特异性刺激物如PHA,ConA,抗CD3抗体等;特异性抗原物质,具体特异性。刀豆蛋白A(ConA)是从刀豆中提取出来的凝集素,属有丝分裂原(mitogen),可与T细胞表面TCR复合物及CD2结合,使其形成细胞表面的分子簇化,促使细胞活化并诱导细胞分裂,为非特异性多克隆活化剂。经ConA作用的淋巴细胞显微镜下观察可见DNA合成增加,细胞体积增大,胞质增多以及出现有丝分裂等。T淋巴细胞增殖活力的高低(淋巴母细胞的转化率)可以反映机体的细胞免疫水平,因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。K8法和同位素掺入法。K8法。
K-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST–8),它在电子耦合剂1-甲氧基-5-***吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)。生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。OD450可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
实验材料
:BALB/C小鼠
:75%酒精、PBS缓冲液()、红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液、胎牛血清、刀豆蛋白A
、血球计数板、计数器、正置显微镜、倒置显微镜、微量移液器、枪头、离心机、酶标仪、解剖器材(眼科剪刀、镊子、酒精棉球)、注射器枕芯、无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管(消毒)
实验内容
,获取脾脏。红细胞裂解液处理离心,用培养基多次洗涤,获得脾细胞悬液。
A刺激脾脏细胞:将细胞调至 4×106 细胞/mL后,分别在24孔板(1ml/孔)与96孔板()进行铺板;细胞培养箱(37℃,5%CO2)中孵育72h左右,培养期间可观察细胞增殖情况。
K8检测:每孔(调零孔、未刺激组、刺激组)加入10 K8溶液,将培养板在培养箱内孵育1-4小时,用酶标仪测定在450nm处吸光度。
实验结果
组别1(无盖)
组别
对照孔
调零孔
ConA
5ug/ml ConA
2x10^6cells/ml
4x10^6cells/ml
组别1(有盖)
组别
对照孔
调零孔
ConA
5ug/ml ConA
2x10^6cells/ml