细菌DNA的提取方法.doc

文档介绍：细菌DNA的提取方法
针对一些不易于提取的细菌的方法:
试验试剂:
抽提缓冲液:2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)(去色素)100mMTris-HCl()
25mMEDTA()
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water(抑制RNA酶活性)
3MNaAc()
96%乙醇
70%乙醇
试验步骤:
1、抽提缓冲液65℃预热。
2、加菌体到已经预热的缓冲液(700ul)中混匀,65℃,10min。
3、加酚/***仿/异戊醇(25:24:1),振荡,以12,000rpm,离心10min。
4、取上清,加***仿/异戊醇(24:1)振荡,以12,000rpm,离心10min。
5、重复再作一次步骤4。
6、加入1/(或加入等体积的异丙醇),-20C下沉淀。
7、以2,000rpm,离心10min。
8、弃上清,以70%乙醇条洗沉淀,也可以再用100%乙醇洗,然后溶解于100ml水中。
 
较为常用的细菌DNA提取方法:
实验步骤:
1、将菌株接种于液体LB培养基,37℃震荡培养过夜。
2、。
3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K,混匀,于37℃温育1h.
4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀,再加入80ulCTAB/NaCl溶液,混匀后再65℃温育10min。
5、加入等体积的酚/***仿/异戊醇混匀,离心4-5min,将上清转入一只新管中,-,轻轻混合直到DNA沉淀下来,沉淀可稍加离心。
6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后,离心弃乙醇.
 
真菌DNA提取总结的两种方法:
第一种方法:
试验步骤:
1、,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入4mL提取液,快速振荡混匀。
3、加入等体积的4mL的***仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚)。
4、以4℃,1000rpm,离心5min。
5、上清再用等体积的***仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃,10,000rpm,离心5min。
6、取上清,加入2/3倍体积的-20℃,混匀,静置约30min。
7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ulTE中。
8、加入1ulRNaseA(10mg/mL),37℃下处理1h。
9、用酚():***仿:异戊醇(25:24:1)和***仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃,10,000rpm,离心5min。
10、取上清,加入1/10倍体积的3MNaAc,,-70℃沉淀30min以上。
11、沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ulTE中,-20℃保存备用。
DNA提取液:-HCl(),,,1%SDS,3MNaAc。
第二种方法:
试验步骤:
1、-1g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入3mL65℃预热的D