文档介绍：转基因小鼠筛选——鼠尾提取基因组DNA方法
小鼠分笼后打耳标,剪取小鼠尾尖3mm-- 离心管中,标记耳标号。
配置消化液,,55℃,3-5h,或放置过夜。(最长可放置3天)。
加1倍体积()PCI(下层液体),上下颠倒10余次。(PCI可分装出一些现用,以免操作不慎污染)。
室温15000rpm离心,10min。
,依次标号,,上下倒转10次左右。
4℃,15000rpm离心,5min。
弃上清,滤纸吸干,加入70%,将管底沉淀弹起,上下颠倒几次,洗涤。
4℃,15000rpm离心,5--7min。
弃上清,瞬时离心,用枪吸干剩余液体,后经空气干燥5-10min。
加入1*TE 60-170μL一般加100μL,振荡30min溶解,于4℃冰箱保存。
注意事项:
小鼠耳标与管号一一对应,在剪尾或提取DNA过程中如发生混淆,则应重新剪尾。
配置消化液时,最后加蛋白酶K,配置完成后混合均匀再分装;分装后依次检查,确认每管的鼠尾都浸入在消化液中。尽量多配一些消化液,以免不够。
提取DNA之前,先检查鼠尾消化情况,过夜消化后,一般只能观察到少量骨骼及鼠尾毛发,如观察到鼠尾组织,说明消化不完全,可能是时间不够或消化液配置不正确。
由于实验中用到的PCI,异丙醇等对身体有害,因此在提取DNA和配置PCI时,应注意防护,戴好口罩和乳胶手套。
实验过程中,应轻拿轻放,避免液体洒出,沾湿手套,洗去Marker笔字迹等情况的发生。为了防止耳标号被擦掉,最好连号摆放。
吸取上清一步中,应保证上清质量,避免下层杂质的吸入,如不慎吸入,应将样品重新离心。
DNA沉淀一般呈白色或半透明胶状,混有杂质时可能带有黑色,提取过程中如观察不到沉淀,应做好标记,重新剪尾。
DNA样品保存于4℃冰箱,保存时应标明剪尾日期,小鼠品系等各项资料,以便查找。
使用离心机时,离心管尽量分散放。
,应用带过滤装置的枪头,以免腐蚀枪。(如酚﹑强酸﹑强碱等。)
,以免加液时混淆。
,如酚等。
消化液配方
1管
4管
10管
20管
40管
60管
80管
20*SSC
25μL