文档介绍：引物设计实例分析
引物设计基本原则
引物长度(primer length)
产物长度(product length)
序列Tm值(melting temperature)
G+position)
引物二聚体及发夹结构
(duplex formation and hairpin)
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1. 引物的长度
一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,即Taq酶的最适温度
扩增片段长度为100~600碱基对.
3. Tm值
引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.
Tm=2(A+T)+4(C+G)
4. 引物的GC含量
有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物自身
引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败
任务
用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1
SP
BamHI
NR1
Plasmid 1:
Plasmid 2
GFP
SP
BamHI()
NR1-1a
GFP