文档介绍：上海交通大学
硕士学位论文
肠杆菌科细菌KPC碳青霉烯酶的研究
姓名:汤瑾
申请学位级别:硕士
专业:临床检验诊断学
指导教师:蒋燕群
20090505
肠杆菌科细菌 KPC 碳青霉烯酶的研究

摘要

目的:了解上海部分医院 KPC 酶的发生及耐药情况。研究产 KPC
菌株的碳青霉烯类耐药机制、KPC 酶的分子生物学特性和 blaKPC 的转移
和传播。运用 RNAi 技术探讨 blaKPC 表达与碳青霉烯类耐药的关系。
方法:、仁济医院、瑞金医院和华山医院收
集亚胺培南或美罗培南药敏结果(纸片扩散法)中介或耐药的肠杆菌科
细菌,用 E-TEST 方法重新测定细菌对各类抗菌药物的最低抑菌浓度
(MIC)。用改良 Hodge 试验和硼酸抑制试验进行碳青霉烯酶表型的筛
选。检测 blaKPC、测序,PCR 检测膜孔蛋白 OmpK35、OmpK36、
OmpK37 的编码基因。 KPC 酶菌株做接合试验、质粒电泳、等电
聚焦电泳、Southern blot 试验。 SiRNAs,对 blaKPC 的表达进
行 RNA 水平的干扰,检测实验菌株干扰前后亚胺培南和厄他培南的 MIC
值。
结果:本研究在上海部分医院共收集到 7 株对亚胺培南药敏结果(纸
片扩散法)中介或耐药的肠杆菌科细菌。E-TEST 试验结果显示实验菌株
对亚胺培南和厄他培南的 MIC 值在 4-32µg / ml,所有实验菌株对三代头
孢菌素均耐药。硼酸抑制试验有 5 株阳性结果,改良 Hodge 试验有 4
IV
株阳性结果。 PCR 检测 blaKPC 结果显示有 2 株菌株携带 blaKPC-2。PCR
检测显示膜孔蛋白 OmpK35 编码基因缺失。接合试验、质粒电泳、southern
blot 试验显示 blaKPC-2 是由一个 50kb 大小的可接合性质粒携带,等电聚
焦电泳显示实验菌与接合菌都有的β-内酰胺酶。实验菌株在 RNAi
前后亚胺培南和厄他培南的 MIC 值都是 32µg / ml。
结论:-2006年的临床分离株中共检测到2株产
KPC-2的肠杆菌科细菌,说明KPC酶的发生率还比较低。硼酸抑制试验
的敏感性要高于改良Hodge试验,阳性结果需要继续检测blaKPC。
检测blaKPC和膜孔蛋白编码基因结果证明,肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐
药是由KPC酶合并膜孔蛋白OmpK35缺失共同引起。
的4株产KPC-2的肠杆菌科细菌中,blaKPC都是由1个50kb的可转移性质粒
所携带。4. 国内首次运用RNAi技术研究细菌的基因表达。干扰实验显示
SiRNAs虽然能在RNA水平上抑制blaKPC的表达,但对实验菌株碳青霉烯
类耐药的影响不明显,证明革兰阴性杆菌对碳青霉烯类耐药由多种因素
共同引起。
关键词:碳青酶烯酶、KPC 酶、肠杆菌科细菌、SiRNA
V
THE STUDY OF K. PNEUMONIAE CARBAPENEMASE
(KPC) IN ENTEROBACTERIACEAE

ABSTRACT

Objective: The aim of this study is to investigate the resistance
mechanisms, molecular characteristics and prevalence of KPC in
Enterobacteiaceae clinical isolates from Shanghai several hospitals. The
relationship of blaKPC. expression and Carbapenem-resistant phenotype
was studied by means of SiRNA interfering technique.
Methods: 1. Carbapenem-resistant (or intermediated) or
Meropenem-resistant (or intermediated) Enterobacteiaceae clinical isolates
were screened by disk diffusion and confirmed by E-test.
Carbapenemases was determined in terms of the modified Hodg