文档介绍：层析技术
第七章
层析技术
第一节层析的基本原理及分类
第二节凝胶过滤层析凝胶过滤层析
第三节离子交换层析
第四节疏水性相互作用层析
第五节亲和层析
第六节反相层析
第一节层析的基本原理及分类
一、层析的基本原理
层析是根据混合物中溶质在互不混溶的两相之间分配行为的差别,引起移动速度的不同而进行分离的方法。典型的柱层析分离设备示于图7-1中。
图7-1柱层析分离设备
第一节层析的基本原理及分类
互不混溶的两相分别称为固定相(stationary phase)和流动相(mobile phase)。固定相填充于柱中,在柱的顶端(入口)加入一定量的料液后,连续输入流动相,料液中的溶质在流动相和固定相之间发生扩散传质,产生分配平衡。由于各组分在固定相中的分配系数(或溶解、吸附、交换、渗透或亲和能力)的差异,使各组分随流动相移动的速率不同,分配系数大的溶质在固定相上存在的几率大,随流动相移动的速度小。因此当流动相移动一定柱长后,使各组分在层析柱内分层,从而达到各组分分离的目的。在层析柱出口处各个溶质的浓度变化如下图7-2所示。
第一节层析的基本原理及分类
图7-2 层析柱出口处各个溶质的浓度变化
在定温定压条件下,当色谱分离过程达到平衡状态时,某种组分在固定相S和流动相m中含量(浓度)C的比值,称为平衡系数K(也可以是分配系数、吸附系数、选择性系数等)。
第一节层析的基本原理及分类
其表达通式可写为:
(7-1)
式中 K——平衡系数(分配系数、吸附系数、选择性系数等);
Cs——固定相中的浓度;
Cm——流动相中的浓度。
平衡系数K主要与下列因素有关:①被分离物质本身的性质;②固定相和流动相的性质;③色谱柱的操作温度。一般情况下,温度与平衡系数成反比,各组分平衡系数K的差异程度决定了色谱分离的效果,K值差异越大,色谱分离效果越理想。
第一节层析的基本原理及分类
在色谱柱(纸、板)中,溶质的移动速度与流动相的移动速度之比,称为阻滞因数或比移值Rf,其定义式可写为:
令As为固定相平均截面积,Am为流动相平均截面积,则系统或柱的总截面积At=As+Am。设体积为V的流动相流过色谱系统,流速很慢,可以认为溶质在两相间平衡,则:
第一节层析的基本原理及分类
流动相移动距离= V/Am
由阻滞因数的定义式可得:
因此,当Am、As一定时(与装柱时的紧密程度有关),一定的平衡系数K有相应的Rf值。
混合液中各组分经色谱柱分离后,随流动相依次流出色谱柱进入检测器,检测器的响应信号—时间曲线或检测器的响应信号—流动相体积曲线,称为色谱流出曲线,又称色谱图,如图7-3所示。色谱图的纵坐标为检测器的响应信号;横坐标为时间t,也可用流动相体积V或距离L表示。
第一节层析的基本原理及分类
(1)基线在操作条件下,色谱柱出口处没有组分流出,仅有纯流动相流过检测器,此时的流出曲线称为基线,如图7-3中OC曲线。使基线发生细小波动的现象称为噪音,如图7-3中的空气峰。基线反映了操作条件下,检测器系统噪声随时间变化的波动情况,稳定的基线应是一条平行于横坐标的直线。
图7-3 色谱图
第一节层析的基本原理及分类
(2)色谱峰当样品中的组分随流动相流入检测器时,检测器的响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线称为色谱峰,峰的起点和终点的连接直线称为峰底。
(3)峰形正常的色谱流出曲线为对称于峰尖的正态分布曲线,如图7-4(a)所示。但实际上,流出曲线并非完全对称,不正常的色谱峰有拖尾峰和前伸峰,如图7-4(b)、(c)所示。
(a) (b) (c)
图7-4 峰形示意图