文档介绍：上海第二医科大学
硕士学位论文
TNF-α和BMP-2诱导人皮肤成纤维细胞表达成骨细胞表型中基因
的差异表达
姓名:何亚峰
申请学位级别:硕士
专业:外科学(骨科)
指导教师:邓廉夫
20040401
虎蚝虰一盏既似し舫上宋赴泶锍晒窍赴硇椭谢虻牟钜毂泶中文摘要【目的】骨形成是一个复杂的过程,是由细胞募集、增殖、骨分泌和成熟以及矿化一系列连续发生发展的过程。细胞因子、靶细胞和成骨微环境是骨形成三个重要条件。皮肤成纤维细胞体外在一定浓度猘和联合诱导下能表达成骨细胞表型,但其中的调控机制不明确。目前对调控机制的研究多局限于某一或某几个方面,而不能对整个系统有一个前面的了解。基因芯片技术是一个新兴的技术,具有简便、高效、高通量和能获取大量信息等特点,运用基因芯片技术筛选联合诱导过程赴鲋称凇⒐腔史置诤统墒炱中差异表达的基因,并对它们进行分析,筛选出候选基因,进行验证,从而对整个调控机制进行较全面的研究,进而阐明调控机制。【方法】采集儿童皮肤标本,分离制备皮肤成纤维细胞,用基础培养液和条件培养液进行培养。通过检测成骨细胞表型标志碱性磷酸酶凸歉扑来选择增殖期和骨分泌成熟期的细胞,抽提总擞肂人基因芯片筛选差异表达的基因,利用用、仁菘夥治龌虻墓δ埽秆〕龊蜓』颉【结果】运用基因芯片筛选,细胞增殖期有趸虿钜毂泶铮渲条基个,其中龌虮泶锷系鳎个基因表达下调。它们分别属于┗因和抑癌基因;胱油ǖ篮驮耸涞鞍祝细胞周期蛋白;赴羌芎驮动;赴蛲鱿喙氐牡鞍祝铣珊托薷础⒅刈榈鞍祝岷稀⒆录和转录因子;赴芴澹免疫相关蛋白;赴藕藕痛ǖ莸鞍祝籷谢;∞蛋白翻译合成;⑩发育相关蛋白;㈣其他【结论】谠鲋称灿条基因差异表达,其中趸虮泶锵碌鳎条基因表达上调。经过筛选我们发现、、基因可能在皮肤成纤维细胞转化过程起重要作用,调控机制仍需进一步研究。诠腔史置诤统墒炱共有龌虿钜毂泶铮渲个基因表达上调,龌虮泶锵碌鳌I秆〕霾钜毂泶锘蚴勘仍谠鲋称谠黾有矶啵软件分析差异表达的基因,然后使因表达下调,条基因表达上调;骨基质分泌和成熟期差异表达的基因共有
且主要是关于代谢、细胞骨架和细胞运动、细胞信号以及与受体有关的基因。这其中功能比较重要的基因有:、、、、蚦取除了筛选出已报道的成骨细胞表达的基因外,还筛选出未曾报道基因以及目前功关键词:豢凇、人皮肤成纤维细胞、成骨细胞表型、基因芯片、基因差异表达、增殖期、骨基质分泌和成熟能不明确的基因,需要进一步验证。
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猘和一盏既似し舫上宋赴泶锍晒窍赴硇组织工程学的迅速发展为临床疾病的治疗开拓了一个新领域。许多研究已证它们都来源于共同的祖先一未分化的间充质细胞。骨形态发生蛋白在调抗。皮肤成纤维细胞和成骨细胞具有共同的祖先一未分化的间充质细胞,只是分实骨髓基质干细胞在特定诱导条件下,在体外能诱导分化成某些特定功能的细胞,如肝细胞、肌细胞、脂肪细胞等。成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞,控未分化的间充质细胞分化成成骨细胞过程起着重要作用。在体外成骨细胞系培养中,许多家族成员都能促进碱性磷酸酶⒓鬃磁韵偌に兀鬃磁韵激素相关蛋白受体/、徒涸和骨钙素表达,而且能刺激骨样矿化结节形成““’。由于在肌肉组织中能诱导异位成骨作用,表明它能调控生肌细胞分化过程。实验表明:抑制肌母细胞向肌细胞分化,逆转分化途径进而向成骨细胞分化“’。这提示逆转某些终末分化细胞的分化途径,具有反分化功能。猲对成熟的成骨细胞具有抑制效应,抑制蚾确置冢跎俟堑男纬桑ǘ猿晒窍赴疤逑赴淖饔昧私较少。有研究认为:猲阻止成骨细胞前体细胞进入成骨细胞分化途径,而对已经成熟成骨细胞并不影响其形成矿化结节的能力“’。又有研究发现:一芤种芓—榈嫉牡蛲觯虼薚—盏枷赴蛲龅男в赡鼙籅一化条件不同而进入了不同的分化途径,由于具有诱导成骨和反分化作用,因此皮肤成纤维细胞能被诱导表达成骨细胞表型,这在我研究所已得到证实,但是具体的调控机制仍不明确。随着分子生物学技术的发展,基因芯片技术以其简便、高效和高通量的特点日益得到广泛的应用。本研究运用基因芯片技术筛选虰诱导人皮肤成纤维细胞表达成骨细胞表型过程中基因的差异表达,为进一步研究其相关的调控机制提供基础。.%胰蛋白酶材料和方法
实验步骤:人皮肤成纤维细胞来源于瑞金医院步瓢で懈钍鹾笄谐膁ぃ离组织获取成纤维细胞或者先置于冷藏箱中保存数小时再进行分离提取。分诤、牛血清、青霉素/、链霉素痬洗必泰消毒液液旧血清骨钙素放免试剂盒夥啪芤皆嚎萍伎7⒅