文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
肥胖症患者脂肪组织蛋白表达谱差异分析及cathepsin K功能初
步研究
姓名:尹晓
申请学位级别:博士
专业:内科学·内分泌及代谢病
指导教师:罗敏
20040401
肥胖症患者脂肪组织蛋白表达谱差异分析及δ初步研究中文摘要近年来肥胖症患者逐年增加,而肥胖是冠心病、高血压、吞悄虿〉燃膊的主要危险因素之一。,由此认识到脂肪组织在人体能量代谢的调节中起着重要作用,从而成为肥胖症及肥胖相关代谢异常方面研究的热点。随着人类结构基因组计划的完成,蛋白质组学成为下一步的重点。蛋白质组学是指相对于时空变化的蛋白质表达的系统研究,鍪腔虮泶为蛋白质的中间物质,蛋白质才是细胞中的执行生物学功能的分子。由于人类基因、和蛋白质在数量上存在较大差异,如果研究某种细胞或组织的功能,其蛋白质表达谱能提供最直接、呵靠的信息。而双向电泳结合质谱分析是蛋白质组学中的核心技术,本研究的目的就是通过双向凝胶电泳和质谱分析技术来筛选肥胖症患者和正常对照者脂肪组织蛋白表达谱的差异,并对某些差异表达的蛋白做初步的功能研究,希望能进一步明确肥胖症的病因,为其治疗提供靶点。首先,以大鼠脂肪组织为样本摸索适合脂肪组织的样品处理和双向电泳条件。比较了不同成分的蛋白裂解液、三氯乙酸一丙酮沉淀法提纯蛋白溶液、蛋白溶液的除盐过程及不同范围预制胶条对双向电泳结果的影响。结果发现多离液剂的裂解液成分可以增加蛋自的溶解度,使双向电泳分离的效果更好。三氯乙酸一丙酮沉淀和蛋白溶液的除盐过程可以去除溶液中干扰等电聚焦过程的盐离子和脂类物质,使蛋白能更好的聚集于其等电点,从而减少了二维图谱的横拖尾。但是这两种处理都会损失一部分蛋白,相比之下,用脱盐柱处理蛋白损失要少一些。因为人体大部分蛋白的等电点在中性范围,使用窄的中性范围预制胶条可以增加此范围的分辨率,从而可以分离出更多的蛋白点。有了较成熟的双向电泳分离技术,我们将其应用于肥胖和非肥胖个体的脂肪组织,双向电泳分离后硝酸银染色得到的凝胶图扫描后存为图像文件用于上海第二医科大学级博士研究生学位论文
砑治觥砑治鼋峁允玖阶橥计拙个左右蛋白点,,经畉分析两组间有显著性差异的点有约个,我们选择有显著性差异的十个点用于质谱分析。.分析结果得到了七个蛋白点的肽指纹图分别与组织蛋白酶、、两种未知功能蛋白的酶解片段相匹配。然后进一步扩大样本量逝肿⒎欠逝侄哉兆,利用半定量、证实了肥胖患者和『H酥咀橹泶锏腸趍和蛋白水平均有差异。是一种组织蛋白酶,在全身多组织有表达,破骨细胞中表达丰富,它可以降解若干细胞外基质成分,在细胞外基质的重构过程中发挥重要作用。最近有报道发现其在脂肪组织也有表达,但在脂肪组织中的功能尚不是很清楚。最后培养了甃赴瓴⒂盏挤只3墒熘鞠赴ü攵縍和观察在细胞分化不同阶段及蛋白表达情况。发现在细胞分化过程及蛋白表达量逐渐增加,这说明赡苁侵市纬的一个标志物。当然,谥拘纬杉胺逝址⑸讨械木咛遄饔蒙行进一步深入研究。本研究成功建立了适合脂肪组织双向电泳的蛋白样品准备方法和电泳条件,并以这套程序结合质谱分析技术用于筛选肥胖患者和非肥胖对照者脂肪组织蛋白表达的差异,得到了几种差异表达的蛋白质。对辛私徊降研究,发现其及蛋白水平在肥胖个体和正常人间均有差异,而且它还与脂肪细胞分化有关。当然,这些差异表达的蛋白在肥胖发生及脂肪形成中的具体作用还需要体内外的一系列实验来证实,包括功能缺失及过表达的动物和细胞模型等,明确其发生作用的途径可以进一步阐明肥胖症的发病机制,为其预防和治疗提供一定的方向。关键词:肥胖症脂肪组织蛋白质谱双向电泳上海第二医科大学级博士研究生学位论文
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第一部分:脂肪组织蛋白双向凝胶电泳分离技术的建立近来随着生物信息学的发展和人类基因组计划的完成,我们获得了很多基因组序列即B挤矫娴男畔ⅲ淙徽庑┬畔⒖梢允刮颐浅醪搅私庾橹匾煨基因表达方面的情况,但我们还应该意识到并不是细胞中的功能分子,而仅为基因表达为蛋白质的中间状态】,特定细胞或组织中的水平只能用于初步估计其所对应的蛋白在样品中的实际表达量,而研究细胞或组织的蛋白表达谱能更好的了解它的生物