文档介绍：摘要
eDNA文库中获得的一个新锌指蛋自基因, 该基因编码一个含368个氪基酸的Krnpple型锌指蛋白。锌指蛋白ZNFl91由两部分组成:该蛋白N一端的1-242位肽段为非锌指区,其中包含一个富含亮氨酸的保守盒:,由四个连续的Cys:His:型锌指结构单元组成。本实验室曾成功构建了ZNFl91全长蛋白PB及锌指区蛋自PC 的表达及纯化体系,获得了高纯度的野生型PB、Pc蛋白及Pc蛋白的Gly79Ala、 Asn92Leu、Gly79Al“Asn82Leu、Ile81Trp、Ar985Trp等突变体蛋白,同时对上述蛋自的结构和性质展开了一系列研究工作。本论文在上述工作的基础上,重点对PB及PC部分蛋白的拉曼光谱进行了研究,以期获得更为详细深入的结构信息。
ZNFl91锌指区蛋白Pc由四个连续的Krfipple型锌指结构单元组成,在这些锌指结构单元中,z0+与两对His/Cys的配位对于维持该结构的稳定起着重要作用,拉曼光谱可以详细考察蛋白的二级结构,同时还可给出蛋白中His与
金属的配位及Cys形成胱氨酸(Cystitle),因此,该手段是考察zn”与His/Cys的配位情况以及锌指结构稳定性的有力手段。在研究锌指蛋白ZNFl91前,我们首先对Tvr、Trp及Phe的拉曼光谱进行了考察,结果观察到了文献报道的这些游离氨基酸的所有振动峰,从而证实了本实验所用拉曼光谱仪的准确性及灵敏度。本论文运用拉曼光谱考察了PC蛋白由天然状态
到部分变性(热变性)再到全变性(EDTA变性)过程中,Zn2+与His/Cys的配位情况及蛋白二级结构的变化。结果表明,随着蛋白变性,拉曼光谱中出现了 s—s键的伸缩振动峰,表明蛋白中Cys与Zn“配位遭到破坏,并使得巯基氧化形成了s—S键;而拉曼光谱中金属配位状态下His振动峰的消失及游离His振动峰的增强则说明His与zn2+配位也被破坏。与此同时,通过考察酰***I、III 带发现,在上述变性过程中,蛋白的二级结构也随之遭到破坏。因此,通过对
上述PC部分蛋白的拉曼光谱考察,我们就证实了锌指蛋白与zn2+配位对维持锌指结构的稳定起着重要作用。除此之外,。该疏水核中包含一系列芳香型氨基酸间的edge-to. face氢键相互作用,丽芳香型氨基酸的某些拉曼谱线与所处环境存在着密切关系。因此,通过考察蛋白变性过程中这些拉曼谱线的变化也可考察该疏水核的变化情况。最后,在PC部分蛋白的拉曼光谱中,我们还考察了con、Ni:。取代zn2+后PC蛋白,结果表明,这两种离子的取代对PC蛋白的结构影响不大。
本论文还考察了ZNFl91全长蛋白PB在重水交换前后的拉曼光谱。与PC 蛋白不同,PB蛋白的非锌指区含有五个高拉曼活性的Trp,因此,我们在此观察到了Trp的一系列特征振动峰。在PB蛋白的拉曼光谱中,我们考察了重水交换对酰***I、III带的影响,结果发现,重水交换后的酰***I、ⅡI带发生了位移,并与文献报道相一致。我们还考察了重水交换对芳香型氨基酸拉曼谱线的影响。通过上述考察,我们进一步确证了相应拉曼谱线的归属。
关键词; 锌指蛋白拉曼光谱重水交换PB蛋白PC蛋白
Abstract
ZNFl91,which encoded a Krapple—type zinc finger protein of368 amino acids,is isolated from human liver genome%gtl 1 cDNA protein consists of
two domains:the N—terminal peptide of amino acids 1-242 constitutes the non—zinc-
finger domain,which contains a Leu-rich scan box;the C-terminal peptide of amino acids constitutes zinc finger domain,which is made up of four essive Cys2His2一type zinc finger Otlr laboratory we have constructed
essfully the expression and purification system of ZNFl91 full—length proteln—
PB protein,and zinc—finger—region prot