文档介绍：上海第二医科大学
博士学位论文
肿瘤限制性复制腺病毒与自杀基因肝癌基因治疗
姓名:李锋
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:钱关祥
一一—坐丝型坐堕型堕燮肿瘤腰爿性复嗣朦病毒与自杀基因肝癌基因治疗传统的治疗方法包括手术、化疗和放疗仍是首选治疗方案,但是许多病人由于诊很大的进步,显示了良好的应用前景。然而恶性胂瘤基因治疗所取得的疗效并没有达到人们所期望的效果,主要原因在于狈Π踩行У脑靥逑低常,高效~、大肠杆菌嘌呤核苷酸磷酸化酶虻目寺〖捌渲琢錾鄙诵вρ究利用椒ù哟蟪Ω司鶮菌株的基因组寺∴堰屎塑账崃姿峄酶基因,通过龈拾彼岬腖拥絧—载体上,形成发性肝癌细胞中琀和进行了杀伤效应研究,结果发现在较低的前药浓度下,转染的蚨匀指伟┫赴煞⑸飨缘闹琢因的细胞虰中,只嘉要更低的前药浓度就可达到同样的杀伤效死%的肿瘤细胞。这些结果表明我们构建的基因具有良好的肿瘤杀伤作用,为进一步与其它基因构建融合基因提供了良好的基础。同时对痜系统作用后的细胞进行了凋亡检测,结果发现蚓哂忻显的凋亡效应,三种珺和肝癌细胞的凋亡细胞所占二、诤匣虻墓菇ḿ捌涓伟┫赴鄙诵вρ芯原发性肝癌是一种高发的肿瘤,全世界每年至少有蛉怂烙诟貌虽然断和复发等原因,难以获得良好的效果。基因治疗作为一个新的治疗方法取得了的治疗基因。目前在肝癌基因治疗的研究领域中,自杀基因作为一种高效的治疗基因是一个引人瞩目方面,疐低尘哂心壳八5淖钋康呐怨壅效应而引起人们的重视。肿瘤复制限制性腺病毒能够自身进行复制以杀伤肿瘤细胞,而且能高效运载外源基因进入细胞并通过自身复制传递给临近细胞,以提高外源基因的表达,增强杀伤能力,代表了一个载体研究新方向。因此本研究从以下四个方面对痜系统和肝癌限制性复制型腺病毒进行了研究:融合基因。观察了融合基因在肿瘤细胞中的表达情况,对三种原杀伤效应,而且同低表达腟赴啾龋诹街旮弑泶顰基应。旁观者效应研究发现只需%的细胞在前药浓度为疞就可杀细胞的百分比分别为.%,.%、.%。中文详细摘要
据此我们选择了该浓度作为肿瘤细胞杀伤的依据,进一步作了细胞凋亡实验,我较弱的细胞中,融合基因加三种前药的疗效明显增强。上述实验结镜牡诙妇谕粗刈榉ü菇ㄏ俨《镜姆椒ǔ晒菇讼俨《载体,在此基础上我们对虷细胞进行三、舳踊钚匝芯本研究中设计了四种从υ<直鹗谴銮孔釉<耐槐湫秃鸵吧将蛲ü鰃连接于诤匣蛏希菇ǔ真核表达载体,并利用脂质体进行转染三种肝癌细胞等方法验证了融合基因的表达,证明我们构建的融合基因可通过脂质体有效介导在细胞中表达。并用笛檠橹と诤匣虻南赴拘вΑ=峁砻魅诤匣在三种前药单独添加时均可发生肿瘤杀伤效应,三种药物联合应用时其具有明显的协同效应。对的细胞株虷在前药浓度为们发现在该浓度的前药作用下细胞可出现明显的凋亡,三种细胞、蛲鱿赴俜直确直鹞ァ%、.%,较单一的蜃饔糜忻飨蕴岣摺N颐且补鄄斓剑赑/低匙饔孟喽果表明我们构建的融合基因具有良好的肿瘤杀伤效应。由于腺病毒载体的自身特点,其在肿瘤基因治疗中倍受重视。我们采用了细胞增殖和杀伤的研究,结果表明—哂辛己玫肿瘤杀伤和抑制肿瘤增殖的效应。这一步工作为诤匣蚪步的体内实验研究奠定了良好的基础。筒淮銮孔映煞值耐槐湫秃鸵吧虯启动子调控的表达载体和表达载体,在多种细胞中验证了这四种反应元件的转录活性。结果表明带增强子成分的衔拊銮孔映煞值腁贏高表达的细胞株和衅浠钚韵灾玫皆銮浚贏一的其他多种细胞株中四种挥屑ǖ偷幕钚浴M槐湫秃鸵吧偷腁未观察到有显著区别。由于缺乏捅泶锏南赴曜魑6哉眨酝槐湫虯启动子的活性研究尚需进一步研究。但带有增强子成分的从υ<捎谄株珺和。我们首先通过、,.痬/,/时,可明显抑制肿瘤的增殖。型洳涞诙箍仆潦卵鑤雪谨论土
四、肿瘤特异复制型腺病毒载体的构建及其肝癌细胞体外杀伤效应研究因的表达分别构建了四种肝癌特异复制型腺病毒载体,观察了四种病毒的复制特顺反子甀瓻表达盒,构建了..简称—力的特异性研究结果表明两种病毒复制能力在的细胞株虷因此,调控的狪狤人工双顺反子较单一调控能够更严格的限制病毒在幌赴械母粗啤8菀陨辖峁≡馎瓵腺病基因在两种肝癌细胞株和一种肝细胞株况。《揪哂辛己玫母伟┫赴鄙诵вΑ另外针对剔除的复制限制性腺病毒的某些尚未确定的安全因素,如其也能在5南赴杏械偷母粗颇芰Γ狙芯恐蟹直鸸菇薊区域均不能在的肝癌细胞株透蜗赴闏但都可在坏腍细胞中复制,其复制能力要较.《疽5徒倍。对病毒的肿瘤细胞杀伤效应研究的结果显示一也具有较强在粜韵赴械慕锨炕钚院脱细竦淖B嫉骺啬芰κ蛊淇梢越徊接τ糜谥瘤的基因治疗研究。肿瘤特异复制型腺病毒代表了一个肿瘤基因治疗新的研究方向。本研究在上一部分研究的基础上,采用带增强子元件的野生型骺叵俨《綞异性,选择其中两种腺病毒作了迸一步的虻谋泶锖椭琢錾鄙诵вρ芯