文档介绍：聚醚类抗生素盐霉素的高效毛细管电泳—电导分离检测
盐霉素(salinomycin)又名沙利霉素、球虫粉、优素,属于聚醚类抗生素。在实际应用中,常用其钠盐,即盐霉素钠,分子式为C42H69O11Na,。结构式比较复杂,可示意为:
色态:白色或浅棕色无定形粉末,无味
溶解性:微溶于水,易溶于低级醇、乙醚等有机溶剂
稳定性:在中性或碱性环境中稳定,在高温120℃时不失活,在酸性介质中不稳定。
应用现状:
国内外广泛用来防治牛、羊、鸡、兔的球虫病;同时可作为饲料添加剂使用,促进畜禽生长发育和提高饲料利用率。但是聚醚类抗生素使用剂量的安全范围较窄,盐霉素对肉鸡的LD50为150毫克/千克体重。其在饲料中的含量稍大即可使动物的增重减慢,饲料转化率降低。
现有的检测方法:高效液相色谱柱后衍生化法
高效液相色谱柱前衍生化法
分光光度法
本实验采用毛细管电泳—电导检测法(CE—CD)对盐霉素进行分离检测
实验主要内容:
分离条件的选择
重现性、线性范围和检测限
样品测定
缓冲体系种类及其浓度
进样方式
分离电压
提取方法
分离条件的选择——缓冲体系种类及其浓度
缓冲体系种类的选择:
Tris(三羟甲基氨基甲烷)-硼酸:盐霉素得不到检测
Tris:盐霉素得不到检测
醋酸钠-氨水:可检测到盐霉素
Tris-HAc-Cit(柠檬酸):可检测到盐霉素,
且分离度和灵敏度最佳
缓冲体系中各组分浓度的确定:
经过系列试验后发现, Tris-Hac-Cit体系中三种组分的浓度对盐霉素测定的分离度和灵敏度都有所影响
分离条件的选择——缓冲体系种类及其浓度
Tris:主要用于调节缓冲容量以及pH值,但当Tris浓度太大时,水峰后容易形成正峰,影响对盐霉素蜂的测定(图1)。其浓度的大小对灵敏度影响不大。
Hac:浓度增加可避免水峰后的正峰出现,但随着浓度的继续增加,水峰形成拖尾,对盐霉素峰造成干扰(图2)。灵敏度在Hac浓度为1 mmol/L到5 mmol/L之间,随Hac浓度的增加而降低。
图1
图2
Cit:主要用于调节PH值,随着Cit的加入,PH降低,水峰拖尾加重,对盐霉素峰造成干扰。/L之间,随Cit浓度的增加稍微降低。
分离条件的选择——缓冲体系种类及其浓度
综合上述影响因素,确定12 mmol /LTris+1 mmol/L醋酸+ mmol/L柠檬酸为电泳缓冲体系。该缓冲体系,基线平稳,并且在保证该检测方法的灵敏度的同时,不形成正峰,水峰对盐霉素峰的基本无干扰(图3)。
图3
分离条件的选择——进样方式
分别用纯水,1:4甲醇水溶液,1:1甲醇水溶液,无水甲醇制备进样样品,随着甲醇含量的增加,水峰出峰时间推迟,并且与盐霉素的出峰时间差增大,分离度提高。
图4:进样样品中甲醇含量与盐霉素峰面积的关系图
本实验采用
1:1甲醇水溶液
制备进样样品,以取得较高的灵敏度。
分离条件的选择——进样方式
电动进样:
重力进样:
盐霉素峰面积增加,但峰形不对称;
必须用缓冲溶液制备进样样品;
所得到的谱图往往因为水峰后存在正峰而难以对盐霉素峰进行测定
峰面积虽然减小,但峰形佳;
用1:1甲醇水溶液制备进样样品,分离效果理想;
采用重力进样20 s,可得到较好的重现性。
分离条件的选择——分离电压
电压
水峰出峰时间
盐霉素峰出峰时间
出峰时间差
12Kv
3:34
4:08
34 s
10Kv
4:20
5:00
40 s
8Kv
5:32
6:22
50 s
分离电压对出峰时间以及出峰时间差的影响
从上表可看出,随着电压的降低,水峰和盐霉素峰的出峰时间都推迟,并且两者的出峰时间差逐步增大。
在保证水峰不干扰盐霉素峰的前提下,选择使用 12 Kv作为分离电压,可实现在5分钟之内对盐霉素进行检测。