文档介绍：实验七动物组织核酸提取与鉴定
一、实验原理
核酸是生物体最重要的组成成分之一。动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸( DNA)大部分与蛋白质结合,以核蛋白的形式存在。因此分离核酸时必须使核酸与蛋白质分离,并除去蛋白质。
本实验是将组织匀浆后加水饱和酚溶液,振荡使蛋白质变性,变性蛋白质溶于酚相或两界面处形成凝胶层。而DNA或RNA则溶于上层的水盐溶液中。在离心后上层的水盐溶液中加入乙醇,核酸不溶于乙醇而形成白色絮状沉淀析出。
DNA与 RNA均由单核苷酸组成,每个单核苷酸中含有磷酸、嘌呤与嘧啶、戊糖(核糖、脱氧核糖)。核酸用硫酸水解后,即可游离出这三种物质。用下述方法可分别鉴定出这三类物质。
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(1)磷酸:用钼酸铵与之作用可生成磷钼酸,磷钼酸可被氨基萘酚磺酸还原成蓝色钼蓝
(2)嘌呤碱:用硝酸银与之反应生成灰褐色的絮状嘌呤银化合物。
(3)戊糖:
:用硫酸使之生成糠醛,糠醛与3,5-二羟甲苯综合成为一种绿色化合物
:在硫酸作用下,与二苯胺生成蓝色化合物
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二、试剂及器材
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸
3,5-二羟甲苯溶液
二苯胺试剂
%NaCl
20%三氯醋酸
水饱和酚
预冷的95%乙醇
浓硫酸
5%硝酸银
5%硫酸
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实验步骤一:动物组织中核酸的提取
1. 匀浆制备:全班制备一份。取冻存兔肝20g置匀浆器中,%NaCl溶液60ml制成匀浆。
2. 提取:将匀浆取出分装在四个100ml塑料离心管内,分别加入1mol/L NaCl溶液15ml,混匀,再加入水饱和酚溶液40ml,剧烈振荡10min,然后4000rpm离心20min。
将上清轻轻吸入一烧杯中,每2人一组取上清液4ml于小离心管中,加入等量的预冷的95%乙醇,即可见白色沉淀逐渐析出,静置10min后,3500rpm离心10min,倾去上清,即得白色的核酸钠沉淀。
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(2)磷酸的鉴定
管号
水解液
5%硫酸
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸
1
2
10滴
——
——
10滴
5滴
5滴
20滴
20滴
沸水浴中加热数分钟,观察两管颜色变化。
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(3)核糖的鉴定:
管号
水解液
5%硫酸
3,5-二羟甲苯溶液
1
2
4滴
——
——
4滴
6滴
6滴
沸水浴中加热10min,比较两管颜色变化。
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(4)脱氧核糖的鉴定
管号
水解液
5%硫酸
二苯胺试剂
1
2
20滴
——
——
20滴
30滴
30滴
沸水浴中20min观察颜色变化
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