文档介绍：第十一章核酸的体外扩增 聚合酶链式反应 连接酶链反应 RNA的体外扩增
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第一节聚合酶链式反应
polymerase chain reaction PCR
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PCR的发明:
发明人:Kary Mullis。1983年,Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段DNA的技术问题,有一天晚上他驱车在北部加州101号高速公路上,灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段DNA的简单方法,即PCR。 1985年的一次学术会议上,此方法首次被介绍,在分子生物科学家中引起了巨大的反响。大家很快地纷纷采用这个方法,很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。随后 Cetus给了Mullis一万美元的奖金,然后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物技术公司。1993年,Mullis因此获得诺贝尔化学奖。
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Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇,可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下,即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。
在短短的几年内,PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段,被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项突破。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值,并对分子生物学技术的发展给予巨大的推动。
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一、PCR的基本原理
类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与待扩增DNA发生退火,再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环,PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
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flash
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㈠ DNA模板变性
双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性,形成单链DNA。
㈡模板与引物退火
45~55℃,两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。
㈢引物延伸72℃左右
在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下,DNA聚合酶将单核苷酸从引物3′端掺入,沿模板延伸合成新股DNA,每一循环的产物可作为下一循环的模板。
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以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为PCR的一轮循环,整个PCR过程一般需进行25-30轮的循环。
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PCR flash
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二、PCR引物的设计
引物
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸,两段引物分别与相应的一条DNA链3’端及5’端互补。
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