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业
设
计
论
文
二0 年月
PCI2相关差异蛋白质的筛选与鉴定硕士研究生:李丽增导师:王慧君教授摘要研究背景(MethamphetamineMETH)StimulantATS)称“冰毒”,为一种新型毒品,号称“毒品之王,,。因其具有见效快,兴奋作用维持时间长,价格低廉,化学合成技术简单,多途径摄取等特点,使它滥用和蔓延速度极快。因其具有中枢神经兴奋性、致幻、食欲抑制和拟交感能效应等药理、毒理学特性,最初作为抗疲劳剂、减肥药使用。随后发现其具有精神依赖性。现已被列为联合国精神药品公约管制的精神活性物质。研究证明,可导致行为学改变,对心、肝、肾和骨骼肌等组织器官均有毒性作用,但更主要的是其对中枢神经系统的毒性,尤其是多巴胺能系统。可导致大脑黑质、纹状体、海马、皮质等多部位损伤,包括神经细胞凋亡、多巴胺耗竭、多(DAT)究显示可导致体外培养的神经细胞凋亡,表现为细胞核染色质凝集、核DNAMETH认为毒性损伤所致的过量多巴胺的氧化、谷氨酸介导的兴奋性作用、线粒体功能紊乱、神经元凋亡、细胞稳态改变及神经退行性变是导致中枢神经损伤的可能机制,但目前国内外的研究结果尚不足以完全阐明确切的神经毒性机秘。硕士学位论文(yped
我们前一阶段的体内实验研究结果显示引起大鼠脑组织多部位神经NOSNO小胶质细胞激活等。运用蛋白质组学的方法,对注射后大鼠纹状体、皮质、海马等部位部位的差异表达蛋白质进行鉴定和分析,寻找和鉴定出个差3NO碍、蛋白酶体功能失调、凋亡及重要结构蛋白的硝化等可能是神经毒性的主要机制。为了更好更深入的研究的神经毒性机制,本次研究采用多巴胺能神经元体外模型细胞系进行体外实验。细胞在神经生长因子等诱导后,形态学及功能方面向交感神经元分化,由于该神经元特性,目前已做为一个广泛使用的神经元体外模型,用于神经生物、中枢神经系统疾病、神经毒素等方面的研究,也是一个可行的神经蛋白组学研究模型。因此,我们运用细胞系进行体外损伤实验,初步探讨对细胞的毒性损伤作用,并在此基础上运用分子生物学、蛋白质组学及质谱分析技术,对作用后的差异表达蛋白点进行筛选和鉴定,以期在体内实验基础上筛选出新的差异表达蛋白点,并根据蛋白质功能,进一步探讨的神经毒性机制。此外,也为细胞系在后续体外研究提供基础。方法1METHPCI2PCI2DMEM(101100)375C02期,达%汇合后进行实验。实验分为对照组/和实验组,即mmolLMETH%汇合后实验组分别用上述不同浓度处理,对照组加入等体积的‘培养液,继续培养后,倒置显微镜下观察细胞形态改变,ḿ觳庀赴婊盥剩珹/双染法结合流式细胞术检测细胞早期凋亡率,检测试剂盒硝酸还原酶法检测细胞上清液含量。取目的/.疞、mmolL25mmolL20中文摘要
25mmolLMETHPCI2NOSNONOS技术检测细胞下游产物硝基酪氨酸即表达水平。2METHPCI2细胞培养方法同前。细胞生长至对数生长期,达%汇合后,实验组给予25mmolLMETHDMEMMETHPCI2细胞螅コ嘌让赶占赴銹洗两次,痬离心5min(8M4(wv)DTF40mMIPG/痸%椅卤湫,/胄,提取细胞总蛋白质。丙酮沉淀法去除蛋白中杂质。Braford(2DE)IamgescannerlIIImageMaster70瓺计捉蟹治觯莸鞍字实鉜%值寻找出差异表达蛋白点。切取差异蛋白质点,经胶内酶切、肽段抽提后用甌质谱仪获取肽质量指纹图谱褂肕砑灾势椎腜进行数据库检索比对,采用和/硕士学位论文CHAPS4"C
组相比,/淼腜赴赥盍ο灾黾.;westernblot3-NT2188METH10(Dynactin肿影槁,与氧化应激和凋亡相关的蛋白珻瓸斡肽芰看坏拿咐结论1METHPCI2METH度升高细胞形态损伤呈增强趋势。甅艿贾孪赴盍ο陆担盏枷赴蛲觯瓜赴鸑亢蚇活力增加,表达水平增强。凋亡及过量所致的氧化应激参与了对细胞的毒性损伤作用。3METHPCI2架损伤、酶活性失调所致的能量代谢障碍,可能是神经毒性的重要机制。MIM2Creatine关键词:甲基苯丙胺;细胞;细胞凋亡;一氧化氮;蛋白质组学;神经毒性中文摘要subunitproteinActinTubulin琓beta-2Bchainshock90beta,Heat琓proteinl珿琑botulinumtoxin,dehydrogenase。2alpha-lBHSPcognatekDasubstrate
methamphetamine-inducedon1'C12toxicitcellsandrelated:.,瓵lnVeStlgatlon騞琭:stimulants(ATS)ansbutdepletioninjury硕士学位论文neunamedic