文档介绍：干细胞的培养条件是相当严格的,每个成功的研究员对细胞的照顾甚于自己的孩子。而众多的成功经验中,无菌技术无疑是最重要的一条:
做好准备工作。不要急于进行细胞培养,要先设定计划,即步骤、工具、试剂。特别是将细胞用于大规模生产时,尤其如此。经过干热灭菌的容器一般认为可以在一周内保持无菌状态,如果准备多了,用不完的就得重新灭菌,耗费能源、占用灭菌空间;干热灭菌需要一天的时间,当器皿准备不足时,可能错过了最佳操作时间,也许需要很久才能将细胞状态再调整好。
刷玻璃器皿的过程:初洗、泡酸(一天)、自来水冲洗(10遍)、纯化水冲洗(3遍)、注射用水冲洗(3遍)。残留的酸可能会抑制细胞生长,甚至导致细胞死亡,痛失辛苦得来的细胞,一定不能大意。
实验进行前,无菌室及无菌操作台(laminar flow)以及紫外灯照射30-60min灭菌,以75%医用酒精擦拭无菌操作台,并开启无菌操作台风扇运转10min后,才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株,且即使培养基相同亦不共享培养基,以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后,将实验物品带出工作台,以75%医用酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10min以上,再进行下一个细胞株的操作。
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞。必要物品,例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置,其他实验用品用完即应移出,以利于气流通畅。实验用品以75%医用酒精擦拭后方可带入无菌操作台。实验操作应在台面之中央无菌区域,勿在边缘非无菌区域操作。
小心取用无菌的实验物品,避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口,亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后,以手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
无菌操作台内定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜,预滤网(300h/预滤网,3000h/HEPA)。
水槽可添加消毒剂,定期更换水槽内的水。
认真按照操作规程进行实验,一般不会导致污染,很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败。
粉末培养基配置好后(加了血清),一般在4℃下存放尽量不要超过1个月,如在-20℃存放时间可长一些,但最好也不要超过3~4个月,可能对于永生化细胞株来说要求不是太高,我们在过去几年里一直是作原代细胞培养的,细胞娇弱,经验表明放置时间不宜过长。
关于实验用品的清洗与消毒:用过的玻璃器皿先在清水中浸泡30,min以上,然后加少许清洗剂,以超生波洗涤30min左右(如无超声波洗涤器可用软毛轻轻刷洗干净),捞出晾干,再在酪酸洗液中浸泡6-18h(或过夜)后,自来水清洗10-15遍,双蒸水清洗3-4遍,晾干,高压消毒后即可使用。
试剂一定要用自己的。因为并不是每个人的操作都规范,因此相互之间串着用,很容易造成交叉污染。
一次将所有的所需要试剂、工具放入工作台。不要在实验室中途,又出工作间去拿东西,这样增加了污染的机会。
整个操作要快、动作要轻、而且不要处理其他的事情。比如手机响了,最好不要接。最好操作的时候将手机关机。
一般开紫外线照射台的时候,就将培养基、酶、DHANKS液置于室外让其自然升温。这样40min后,温度也升上来了。有很多人将其放到37℃水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生,有的常年不清洗,里面很脏,容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此使用时一定要勤