文档介绍：第三章 DNA物理图谱的构建及序列测定
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物理图谱(physical map)
物理图/限制性图谱(restriction map)是各种限制性内切酶切点在某一DNA分子或DN***段上的排列,由于各酶切点之间的距离是以碱基对(kbp → mbp)表示的,所以可计算出二切点间的绝对距离,因此限制图也称物理图。物理图谱的构建是基因组研究的重要组成部分。
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质粒pBR322的限制图
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一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
细菌核酸内切酶
识别、剪切特殊双链DNA序列
用途:DNA物理图谱构建、DNA序列分析、基因分离、基因定位、DNA重组
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20世纪50年代,Luria &Human、Bertani &Weigle:
噬菌体→细菌菌株1,正常生长。
→细菌菌株2,生长受到强烈抑制;少数存
活,再次感染菌株2,正常生长——受到
宿主的特意修饰。机制?
《***与破碎的试管》
Luria
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菌株
λ噬菌体感染率
K
B
C
K
1
10-4
10-4
B
10-4
1
10-4
C
1
1
1
1
1
寄主控制的专一性(host controlled specificity)
几乎所有研究噬菌体的科学家都将之视为一种有趣但似乎没有什么意义的现象而忽略了。
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1962,Arber(瑞士):宿主的修饰在噬菌体DNA上进行
1965,Arber:宿主所致的限制现象中伴随有噬箘体DNA的大量降解,——宿主对入侵噬菌体的修饰与噬菌体DNA降解密切相关;预言细菌中存在位点特异性限制酶;修饰是宿主***化酶作用结果:建立细菌限制-修饰(R-M)系统概念
如何分离酶?
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Arber假说
细菌中存在具有相同位点特异性的 2种酶:限制性内切核酸酶;***化酶——细菌利用限制酶特异性识别、降解噬菌体DNA;细菌自身DNA分子通过***化修饰酶进行***化修饰保护,阻止限制酶的作用。
细菌的限制-修饰系统是抵御外来侵袭的一种重要措施
1978年诺贝尔生理学或医学奖
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限制性核酸内切酶的发现
1968年,Linn & Arber于大肠杆菌B中发现第一种限制性内切核酸酶(I型:识别特异剪切随机)。
1968年,Meselson & Yuan从大肠杆菌K中获得高纯度限制性内切核酸酶(I型)。
识别DNA序列上特定的位点,但其切断DNA分子时,却具有很大的随机性;兼具修饰功能,活性依赖一种小分子——S-腺苷甲硫氨酸
Meselson错失诺贝尔奖
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1970年,研究有关流感嗜血杆菌的遗传重组问题,噬菌体P22的DNA加入到嗜血杆菌的提取液中,DNA消失了—— Smith从流感嗜血杆菌Rd中分离出第一种II型限制性内切核酸酶——Hind II。
与Arber共享1978年诺贝尔生理学或医学
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