文档介绍：猪精液冷冻保存技术
吉林省农业科学院
李兆华
内容
猪精液冷冻保存的意义
猪精液冷冻技术研究概况
猪精液冷冻技术操作流程
影响猪精液冷冻效果的因素
如何提高冷冻保存后猪精子的繁殖力
1、延长公猪使用年限;
2、获得更大的遗传进展;
2、取代活体公猪的引进;
3、生物安全的保证。
猪精液冷冻保存的意义
从意大利人Spallanzani最早开始研究哺乳动物精液冷冻开始至己有200多年的历史。
猪的精液冷冻研究是从1949年英国人Polge等发现甘油(丙三醇)对牛精子具有抗冻保护作用后开始的。1956年,他首次报道了应这个原理进行猪精液的冷冻操作,并进行人工授精。
1957年Hess等将猪冻精经子宫颈输入,并产下仔猪。
1975年,Pursel等发明了简便的猪精液冷冻和解冻方法,从此打开猪冷冻精液的商品化之路。
(用颗粒状冷冻精液给23头青年母猪输精, 48h后剖检11头,有5头受孕; 25-30d后剖检另外12头,有10头怀孕)
猪精液冷冻技术研究概况
猪精液冷冻技术研究概况
我国从70年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索。
1975年西安市草滩农场试配了8头母猪。
1977年成立了全国猪冻精协作组。
1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头,
近几年:
甘肃农业大学张兆旺教授
南京农业大学芮荣教授
西北农林科技大学李青旺教授
四川农业大学马恒东教授
东北农业大学刘娣教授
上海农科院张德福研究员
猪精液冷冻技术操作流程
精液采集
质量检测
第一次稀释
降温、平衡
(15℃, 5℃)
第二次稀释
平衡
冷冻
保存
猪精液冷冻技术操作流程
颗粒法冻精的冷冻程序
1)新鲜精液在常温、等温条件下,用不含甘油的I液稀释,~2h;
2)缓慢降温至15℃维持4h,再从15℃经1h降至5℃;
3)用等温的含甘油的II液进行稀释。
4)稀释后用液氮熏蒸法制作冻精颗粒。
利用广口液氮罐,以聚四氟乙烯板作为冷冻面,冷冻面与液氮面距离为1~2cm,待冷冻面充分预冷后,用预冷的滴冻管在氟板上连续等量滴冻。其始冻温度为-110~-125℃,滴冻时间控制在60s内完成,加盖熏蒸平衡3~4 分钟后,浸入液氮中保存。
细管法和塑料袋法的冷冻程序
1)新鲜精液在室温下,用稀释液将精液按比例等温稀释,~2h。
2)将精液移入15℃条件下降温平衡3h。
3)在15℃条件下离心(800g,10min), 加入无甘油的I液,缓慢降到5℃,平衡2h,加入含甘油的II液,然后分装。
4)程序冷冻仪冷冻:
初始温度为5℃,以3℃/min从5℃降到-5℃,再于-5℃条件下保持1min结晶,然后以50℃/min从-5℃降到-140℃,然后投入液氮保存。
5)液氮熏蒸冷冻:
在广口液氮罐内,与液氮面距离5cm处,熏蒸20分钟,然后投入液氮保存。
影响猪精液冷冻效果的因素
个体的影响
个体对精液冻后效果影响极大。应用限制性片断长度多态(AFLP)分析控制精子冷冻能力的基因,没有发现差异。差异的机制仍需要继续研究
冻前处理的影响
冷休克:可能原因是质膜中特别的组成成分所致。
猪精子膜磷脂酰胆碱的含量较牛低,而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量高
胆固醇/磷脂的比例低,且胆固醇的分布不对称,外膜的分布量大于内膜
离心:800g,10min
影响猪精液冷冻效果的因素
冷冻保存承载工具的影响
承载工具:颗粒、、;
5mL 的大型细管
5mL塑料袋。如FP(Flat-Pack,300mm×22mm×)和MFP(a multiple Flat-Pack)。
冷冻解冻程序的影响
冷冻速率:30~50℃/min。解冻速率:1200~1800℃/min
冷冻 :50℃/min、%甘油浓度;
:30℃/min、3%甘油浓度;
5mL大型细管:16℃/min 、%甘油浓度。
解冻 、:50℃,12s或37℃,20s;
5mL细管:50℃,40s
5mL塑料袋:50℃,13s
影响猪精液冷冻效果的因素
稀释液的组成
大体上,包括糖,蛋白质,脂类,缓冲剂,冷冻保护剂和一些添加物质。
渗透压的影响
最佳渗透压:420~580mOsm/Kg为最佳渗透压
糖的影响
双糖(半乳糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等) 顶体完整率;
单糖(尤其是果糖和木糖) 精子冻后活率。
配合使用效果比单一使用好