文档介绍：第8章细胞的冷冻保存复苏技术
♦细胞株(系)的使用,为医学研究和测试工作
带来了极大的方便。但细胞的传代是有限
制的,长期连续传代的细胞,不仅消耗大
量的人力和物力,而且细胞的生长与形态
等会有一定退变或转化,因而细胞失去原
有的遗传特性,有时还会由于细胞污染而
造成传代中断,种子丢失。因此,在实际
工作中常需冻存一定数量的细胞,以备替
换使用。细胞冷冻与复苏是细胞培养室的
常规工作和通用技术。
第一节细胞的冻存
一、概述
♦目前,细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存
法,主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细
胞。
♦细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻,细胞
内外的水分会很快形成冰晶,从而引起一系列不
良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高,
pH值改变,部分蛋白质由于上述原因而变性,
引起细胞内部空间结构紊乱,溶酶体膜由此遭到
损伤而释放出溶酶体酶,使细胞内结构成分造成
破坏,线粒体肿胀,功能丢失,并造成能量代谢
障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细
胞膜通透性的改变,使细胞内容物丢失。
♦如果细胞内冰晶形成较多,随冷冻温度的
降低,冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间
构型发生不可逆的损伤,而致细胞死亡。
因此,细胞冷冻技术的关键是尽可能地减
少细胞内水分,减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种
物质分子量小,溶解度大,易穿透细胞,
可以使冰点下降,提高细胞膜对水的通透
性,且对细胞无明显毒性。
♦慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细
胞外,减少胞内形成冰结晶的机会,从而
减少冰晶对细胞的损伤。
二、主要冷冻设备和材料
♦常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器,规
格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下
几点:
,至少一个月充氮
一次。液氮温度达-196℃,使用时注意勿让
液氮溅到皮肤上,以免引起冻伤。
,中间为真空层,瓶
口有双层焊接处,应防止焊接部裂开。
,要注意缓慢小心,并用厚
纸卷筒或特制漏斗作引导,使液氮直达瓶
底,如有专用液氮灌注装置则更好。若为
初次使用,加液氮时更要缓慢,以免温度
骤降而使容器损坏。
♦细胞冻存时常备的材料有:%胰蛋白
酶,含10%~20%的血清培养液,
DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸
气高压消毒),2mL安瓿(或专用细胞冻存
管)、吸管、离心管、喷灯、纱布袋(或
冻存管架)等。
三、细胞冻存方法
选择处于对数生长期的细胞,在冻存前一
天最好换液将多个培养瓶中的细胞培养
液去掉,% 胰蛋白酶消化。适时去
掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。
用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细
胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮
生产细胞则不要消化处理。然后将细胞
收集于离心管中离心(1000r/min,10分
钟)。
去上清液加入含20%小牛血清的完全
培养基,于4℃预冷15分钟后
逐滴加入已无菌的DMSO或甘油,用吸管轻
轻吹打使细胞均匀,细胞浓度为3×106~
1×107/mL之间。
将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料
管中,安瓿装1~
口,封口处要完全封闭,圆滑无勾。冷冻
管要将盖子盖紧,并标记好细胞名称和冻
存日期,同时作好登记(日期、细胞种类
及代次、冻存支数)。
将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋
内,置于液氮容器颈口处存放过夜,次日
转入液氮中。
采用控制降温速度的方法可采用下列步
骤:
①先将安瓿置入4℃冰箱中2~3小时。
②再移至冰箱冷冻室内3~4小时(此步可省
略)。
③再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时。
④最后沉入液氮中。
♦细胞冻存在液氮中可以长期保存,但为妥
善起见,冻存半年后,最好取出一只安瓿
细胞复苏培养,观察生长情况,然后再继
续冻存。