文档介绍：大肠杆菌检查实验报告实验三Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白一、实验目的利用WesternBlotting技术,定性检测苦荞黄***醇合酶基因在大肠杆菌表达宿主菌EscherichiacoliBL(DE3)中的诱导表达。二、实验原理黄***醇合酶属于2-ODD家族,催化黄***醇合成支路中最后一步氧化反应,也是直接合成黄***醇的反应。FLS 可以使二氢黄***醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键,从而生成黄***醇:aDihydroflavonol+2-oxoglutarate+O2aFlavonol+inate+CO2+H2O。本实验采用PCR的方法,在苦荞黄***醇合酶基因ORF起始密码子前引入Kpn?酶切位点,去掉终止密码并引入BamH?酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中,其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6×His标签。(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0h、2h、4h、6h和8h的产物,经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Westernblotting分析。 Westernblotting的标准流程如下:蛋白质首先通过SDS-PAGE***凝胶电泳分离,通过电泳转移到固相支持物上;将膜上未反应的位点封闭起来,以抑制抗体的非特异性吸附,固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6×His发生抗原-抗体特异反应,再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG与一抗发生特异结合,最后使用DAB进行显色。DAB即:二氨基联苯***,是过氧化物酶的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累,形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性,它灵敏度高,特异性好,在免疫组化,原位杂交,Westernblotting等膜显色中应用广泛。三、操作步骤样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。材料与试剂: 重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、(DE3)、LB固体培养基、LB液体培养基、Kan、IPTG、PBS缓冲液、5XSDS上样缓冲液。仪器与设备: 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip、微量加样器、离心管。操作步骤: ①含重组质粒pET-30b(+)-(DE3)划线于LB固体培养基,37℃培养16h。②挑选单菌落,接种至10mLLB培养基于37℃过夜培养,即为种子液。③按2%的接种量将种子液接种到50mLLBKan培养基中,于37℃培养OD600至。④加入IPTG至终浓度为1mmol/L,置于25℃连续诱导表达8h,分别取诱导前0h,诱导后2h、4h、6h和8h的培养液5mL于10mL离心管中,置于冰水混合物上备用。⑤诱导完毕后,各样品于8000rpm离心5min收集沉淀,用等体积PBS重悬漂洗细胞2次,收集菌体。⑥各管分别加入400μLPBS重悬细胞,加入100μL5XSDS上样缓冲液,置于沸水浴中10min。注意事项: ①重组蛋白(转载于:写论文网:大肠杆菌检查实验报告)的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素,避免可能的污染。②在合适的盐浓度下,应保持蛋白质的最大溶解性。③选择合适的表面活性剂和还原剂,破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子。④制备过程应在低温下进行,以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。⑤样品建议分装成合适的量,然后保存与-20°或-80℃中长期保存,但要注意不要反复冻融,因为会使蛋白的抗原特性发生改变。 SDS-PAGE SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。因为SDS-PAGE上样缓冲液含有SDS和巯基乙醇或二巯基赤藓醇,其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成SDS-蛋白质复合物。该复合物形成榛状结构,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,使其带有大量的负电荷,从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。材料与试剂: ①分离胶缓冲液。②浓缩胶缓冲液。③30%丙烯酰***/N,N'-亚***双丙烯酰***:gAcr,gBis,定容至100mL。④10%过硫酸铵,需新鲜配制。⑤2X上样缓冲液:含mol/LTris-HCl2mL,甘油2mL,20%SDS2mL,%溴酚蓝mL,2-β-巯基乙醇mL,定容至10mL。⑥电极缓冲液:g