文档介绍：质粒dna的提取实验报告实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】 1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤 2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理: 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于~这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此复性迅速而准确,而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,复性就不会那么迅速而准确,它们缠绕形成网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。二、仪器与试剂 1、仪器恒温摇床、台式离心机 2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤 1、将2mL含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中,接入含pUC19 质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。 2、取培养物倒入微量离心管中,4000r/min离心2min。 3、吸去培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。 4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中,充分混匀,室温放置10min。 5、加200μL溶液Ⅱ,盖紧管皿,混匀内容物,将离心管放冰上5min。 6、加入150μL溶液Ⅲ,盖紧管口,颠倒数次使混匀。冰上放置15min。 7、1XXr/min,离心15min,将上清转至另一离心管中。 8、向上清中加入等体积酚:氯仿,反复混匀,1XXr/min,离心5min, 将上清转移到另一离心管中。 9、向上清加入2倍体积无水乙醇,混匀后,室温放置5~10min。1XXr/min,离心5min。倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 10、用1mL70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀,振荡并离心,倒去上清液,真空抽干或空气中干燥。 11、加20μLTE缓冲液,其中含有20μg/mL的胰RNA酶,使DNA完全溶解,-20℃保存。第二部分琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验原理: DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子。如实验提取的pUC19质粒,有3种构型:超螺旋的共价闭合环状质粒DNA,开环质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂,线状质粒DNA,即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带,超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。二、仪器与试剂 1、仪器琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、电炉子 2、试剂5×TBE、凝胶加样缓冲液、琼脂糖、溴化乙锭溶液三、实验步骤制备琼脂糖凝胶称取琼脂糖,放入锥形瓶中,加入10mL×TBE缓冲液,加热至完全溶化,摇匀,则为1℅琼脂糖凝胶液。胶板的制备 1、取有机玻璃内槽,洗净,晾干。 2、将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。 3、将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。 4、待胶凝固后,取出梳子,放在电泳槽内。 5、加入电泳缓冲液至电泳槽中。加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔。电泳 1、接通电泳槽与电泳仪的电源。 2、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处,停止电泳。四、实验结果在紫外灯下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。第三部分PCR扩增制备目的基因一、实验原理: 是将待扩增的DNA模板加热变性,与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性,然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。经过变性—复性—延伸的n次循环后,DNA可被扩增2n倍。二、仪器与试剂 1、仪器PCR仪 2、试剂模板DNA、TaqDNA聚合酶、引物、10×Buffer、DNAMarker 三、实验步骤加样:在PCR微量离心管中配制25μl反应体系。 ddH2Oμl 10×PCRμl dNTPμl 10μmol/Lμl 10μmol/Lμl 模板DNAμl 总体积25μl 将PC