文档介绍：实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化实验目的:学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。实验要求:掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。技术应用:高等植物(双子叶植物或单子叶植物)转基因鉴定基因功能,包括过表达(诱导型或组成型),RNAi等。实验材料:农杆菌GV3101菌株,重组双元表达载体pCAMBIA1300试剂:YEB液体培养基(液体和固体),Kan(卡那霉素),Rif(利福平);CaCl2(预冷);NaCl;50%无菌甘油。实验原理::第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。菌种:根癌农杆菌和发根农杆菌,二者均属革兰氏阴性菌,对双子叶植物侵染广泛,在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。: 一部分为卸甲Ti质粒,这类Ti质粒由于缺失了T-DNA区域,完全丧失了致瘤作用,主要是提供Vir基因功能,激活处于反式位置上的T-DNA的转移。另一部份是微型Ti质粒(Mini-Tiplasmid),它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记,如NPTII基因以及LacZ基因等。双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移。双元表达载体双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300的结构⑴挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml的新鲜YEB(无抗)液体培养基中,28℃200r/mim振荡培养过夜;⑵按1:100的比例接种于50mlYEB(利福平Rif125mg/L)的培养基中扩培,28℃继续培养至OD600=-。将菌液置于冰上30min;⑶,5,000rpm,4℃离心5min,弃上清,(预冷)