文档介绍：实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的：学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
实验要求：掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
技术应用：高等植物（双子叶植物或单子叶植物）转基因鉴定基因功能，包括过表达（诱导型或组成型），RNAi等。
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实验材料：农杆菌GV3101菌株，重组双元表达载体pCAMBIA1300
试剂： YEB液体培养基（液体和固体），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）； CaCl2(预冷)；NaCl；50%无菌甘油。
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实验原理：
1. 农杆菌简介：第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
菌种：根癌农杆菌和发根农杆菌，二者均属革兰氏阴性菌，对双子叶植物侵染广泛，在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
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2. 双元表达载体系统
双元表达载体系统主要包括两个部分：
　　一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
　　另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记，如NPTII基因以及Lac Z基因等。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。
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双元表达载体
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双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
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⑴ 挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB（无抗）液体培养基中，28℃ 200r/mim振荡培养过夜；
⑵ 按1：100的比例接种于50 ml YEB（利福平Rif 125 mg/L）的培养基中扩培，28℃继续培养至OD600=-。将菌液置于冰上30min；
⑶ ，5,000 rpm，4℃离心5min，弃上清， ml（预冷）