文档介绍：实验一农杆菌感受态细胞的制备
[目的及要求]
了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。
[实验原理]
在利用根癌农杆菌介导的基因转化中,首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。
在基因工程操作中,感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中,0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。
[实验仪器、材料和试剂]
一、仪器:超净工作台,恒温摇床,冷冻高速离心机,高压灭菌锅,冰箱,-70℃超低温冰柜,分光光度计,接种针,10ml试管,50ml离心管,,冰浴,微量进样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌,灭菌条件:120℃,15分钟。
二、材料:土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株
三、试剂:YEB液体培养基(1L):酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g,MgSO4·7H2O ,,高压灭菌。
利福平(Rif)储液:50mg/ml
20mM CaCl2,高压灭菌。
[实验步骤]
1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基(含Rif 50mg/l)中,28℃振荡培养过夜;
2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB(Rif 50mg/l)液体培养基中,28℃;
3、取2ml菌液,13000rpm,离心30sec, 弃上清;
4、加入1000µl 20mM CaCl2,使农杆菌细胞充分悬浮,冰浴30min;
5、13000rpm,离心30sec,弃上清,置于冰上,加入500µl预冷的20mM CaCl2,充分悬浮细胞,冰浴中保存,24hr内使用,或液氮中速冻1min,置-70℃保存备用。
实验二质粒DNA直接导入农杆菌
[目的及要求]
了解和掌握质粒DNA转化农杆菌细胞的原理和方法,获得能用于植物转化的工程菌。
[实验原理]
在低温下,外源DNA(质粒)可吸附到感受态细胞表面,诱导细胞吸收DNA。(加入热激原理)转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养,可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达,因此,转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长,而没有转化的细胞则无法生长。
植物真核表达载体pCAMBIA1300图谱
[实验仪器、材料和试剂]
一、仪器:超净工作台,恒温摇床,培养箱,台式离心机,水浴锅,高压灭菌锅,-70℃超低温冰箱,培养皿,微量进样器及吸头。
材料:根癌农杆菌LBA4404(或EHA105)感受态细胞,质粒pCAMBAI1300+SPR植物表达载体
二、试剂:液氮
YEB液体培养基(1L):酵母提取物1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g,MgSO4•7H2O ,,高压灭菌。
YEB固体培养基:每升YEB液体培养基加15g琼脂粉,高压灭菌。
卡那霉素(Kan)储液:50mg/ml
利福平(Rif)储液:50mg/ml
YEB固体培养基平板(Kan抗性):灭菌后的YEB