文档介绍：实验五、农杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的:学习农杆菌感受态细胞的制备和转化原理。
实验要求:掌握农杆菌的特点及真核表达载体结构及应用。
技术应用:高等植物(双子叶植物或单子叶植物)转基因鉴定基因功能,包括过表达(诱导型或组成型),RNAi等。
实验材料: 农杆菌GV3101菌株,重组双元表达载体pCAMBIA1300
试剂: YEB液体培养基(液体和固体),Kan(卡那霉素),Rif(利福平); CaCl2(预冷);NaCl;50%无菌甘油。
实验原理:
1. 农杆菌简介: 第一例转基因植物就是用农杆菌介导法完成的。
菌种:根癌农杆菌和发根农杆菌,二者均属革兰氏阴性菌,对双子叶植物侵染广泛,在某些条件下对单子叶植物也有一定的感染性。
2. 双元表达载体系统
双元表达载体系统主要包括两个部分:
一部分为卸甲Ti质粒,这类Ti质粒由于缺失了T-DNA 区域,完全丧失了致瘤作用,主要是提供Vir基因功能,激活处于反式位置上的T-DNA的转移。
另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid),它在T-DNA左右边界序列之间提供植株选择标记,如NPTII基因以及Lac Z基因等。
双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA 的转移。
双元表达载体
双元表达载体中Ti质粒pCAMBIA1300 的结构
⑴挑取农杆菌GV3101单菌落接种于3ml 的新鲜YEB(无抗)液体培养基中,28℃ 200r/mim振荡培养过夜;
⑵按1:100的比例接种于50 ml YEB(利福平Rif 125 mg/L)的培养基中扩培,28℃继续培养至OD600=-。将菌液置于冰上30min;
⑶,5,000 rpm,4℃离心5min,弃上清, ml(预冷) mol/