文档介绍：依博素生物合成基因ste15的克隆表达及酶学性质研究
李晓华李元
(中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所北京 100050)
摘要:
目的测定依博素生物合成基因ste15的酶学性质。方法将ste15基因克隆至质粒pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,用连续偶联分光光度法对纯化的Ste15蛋白进行酶活性测定。结果 SDS-PAGE结果显示在大约50kD处出现了一条新的蛋白条带,与推测值相符。,二者各占50%,取可溶形式的蛋白用镍亲和柱层析纯化,得到单一条带蛋白。Ste15蛋白只催化UDP-葡萄糖转移到糖基接受体上,生成UDP,偶联NADH的氧化反应,而对其他几种活化糖基供体没有催化活性。结论 Stel5蛋白是葡萄糖糖基转移酶,负责依博素生物合成中将核苷酸葡萄糖到多糖重复单元增长链的转移。
关键词:链霉菌,基因表达,依博素生物合成葡萄糖糖基转移酶
依博素是一种由链霉菌139 (Streptomyces. )产生的可能用于治疗类风湿性关节炎的I类新药,正在申报临床[1]。依博素由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖和半乳糖糖醛酸共8种单糖组成[2]。依博素生物合成基因簇ste已被确定,其中ste15基因的大小为1,269bp,编码一个422-aa的蛋白[3]。同源性比较表明其编码产物的C端(217-369aa)含有类似pfam00534的结构域,属于糖基转移酶家族1,该家族的糖基转移酶催化UDP、ADP、GDP 或 CMP 连接的活化糖基转移至作用底物,包括糖原,6-磷酸果糖,脂多糖。本室通过基因同源重组双交换获得基因缺失变株Streptomyces sp 139(ste 15-)[4],与依博素相比,该变株产生的多糖衍生物EPS-15m,葡萄糖组分消失(%→0%),遗传互补株ste15c产生的多糖衍生物EPS-15c,葡萄糖组分得到一定恢复(0%→%)[4],由此推测ste15基因可能编码葡萄糖糖基转移酶,参与依博素的生物合成。本文对ste15基因进行了克隆和表达,用连续偶联分光光度计测量分析法测定了该蛋白的酶学活性,确定其为葡萄糖糖基转移酶,负责依博素生物合成中将核苷酸葡萄糖到多糖重复单元增长链的转移。
1 材料和方法
ste15基因的克隆和表达
,以5-ATGGTCATGCACGTCATGGTGG-3 (NcoI)和5--3 (HindIII)为引物,进行PCR反应,反应条件为:95℃ 3min;94℃ 45s,50℃ 50s,72℃1min,共30个循环;72℃ 10min。扩增的片段与pET30a质粒相连, BL21(DE3)受体菌,获得转化子。转化子提取质粒后进行酶切鉴定,含预期片段的重组质粒命名为pET30a-Ste15,重组菌株命名为BL21/pET30a- ste15,并进行序列测定。将BL21/pET30a- ste15 按1%接种于含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基,37℃,加入IPTG(),诱导4h后,收集菌体。
重组Ste15蛋白的纯化
将诱导表达后的菌体以5ml