文档介绍：医学生物学研究技术与实验
实验报告
实验名称:DNA重组与细胞转化,重组DNA的提取及酶切鉴定
一、实验目的
( HB101)
(c-myc + pBR322;粘端连接)
(HB101 ;Ampr)
4. 质粒DNA的小量快速制备
5. 质粒DNA的限制性内切酶酶切
6. DNA的琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理
1. 细菌转化
体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞,否则会很快降解,而且只有导入到细胞中后,才能进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白,细胞转化是常用也是最有效的方法之一。
能够作为重组体转化的受体,主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径重要有转化(转染),显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下,细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入,而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。
细菌转化是指裸露的(或纯化的)DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。
细胞处于能够吸收DNA的状态称感受态,处于感受态的细胞称作感受态细胞。
大肠杆菌的感受态需诱导。野生型大肠杆菌并不容易转化,这是由于DNA无法进入野生型大肠杆菌的细胞。经过多年的努力,科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞,使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞,即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术,它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。细菌的感受态有两种类型:一种是自然感受态(petence),自然感受态细菌可以自由地吸收DNA,通过它来进行遗传转化;另一种是人工感受态(petence),在这种转化中,细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。枯草芽孢杆菌属于能够发展为自然感受态的细胞,大肠杆菌就属于需要人工处理的细胞。
将对数生长期的细菌放入0℃的CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀,形成原生质球,诱导感受态;DNA加入后,形成抗DNase的基磷酸钙复合物,粘附于原生质球表面,42℃热冲击,DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面,双链DNA分子解链变成单链,单链DNA分子一条进入受体细胞内,另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA,随同复制子同时复制,并被转录翻译。将细胞混合物涂布于筛选培养基几小时,细胞得以恢复和复壮,转化基因得以表达,然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。
本次实验将用EcoR I和Cla c-myc DNA片段在T4 DNA连接酶的作用下,连接入同样经EcoR I和Cla I切开的pBR322质粒载体上, HB101菌株为受体细胞,用CaCl2处理受体菌,使其处于感受态,然后与pBR322质粒共保温,实现转化。pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素特性,用Ampr表示。将经过转化后的受体细胞在含有氨苄青霉素培养基上培养,只有转