文档介绍：宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划起草人:李浩宇宏基因组学研究方向及意义研究:环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。发掘:环境应激和应答基因的多态性。探究:多态性基因的功能。实验大体步骤::1)避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。2)样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理,特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液(多为PBS)重悬,离心收集沉淀。分装成小份,冻存于液氮或者‐80℃冰箱中,避免反复冻融。3)如果后续用间接法提取总DNA的话,此处需要收集菌体,采取的策略是稀释之后的差速离心,一般适用于水样。:总DNA的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。直接提取法就是直接对样品进行裂解,释放其中的DNA。间接提取法则是先分离样品中的微生物,后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同,各自都有优缺点。直接提取法的优缺点:直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等)总DNA的试验中。其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显,所得DNA的纯度远不及间接提取法所得,基质中含的腐殖质一并被保留下来,使得所得DNA呈现黄褐色甚至黑色。可以考虑MoBio和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。间接提取法的优缺点:间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA也可以用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA时,需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取DNA纯度高,既使在提取固体样品微生物总DNA时,也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA得率低。土壤DNA直接提取法:(1)从超低温冰箱中取出保存样品(5g);(2)于室温融化;(3);(4)离心管于37oC225rpm水平振荡30min;(5)%SDS;(6)65oC水浴2h,每隔15min轻轻颠倒数次;(7)室温6,000g离心10min,收集上清液,转移至一个新的50ml离心管中;(8)%SDS,轻轻涡旋至混匀;(9)浸入液氮中冷冻3min后,于沸水中煮沸3min;(10)室温6,000g离心10min,收集上清液,与上次上清液合并;(11)重复(8)、(9)、(10)一次;(12)将三次提取所获上清液与等体积的苯酚:氯仿(1:1v/v)混合,摇匀后于4℃12,000g离心10min;(13)将上层水相转移至一新的50ml离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀后于4℃12,000g离心10min;(14)再次转移上清至一新的离心管中,;(15)室温12,000g离心20min;(16)收集沉淀,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀;(17)向离心管中加入1mlTE,于4℃放置过夜,分装保存于‐20℃。实验过程中的注意事项及一些技巧:(1)整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。(2)用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。(3)酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到,宁可多丢弃一些。(4)异丙醇沉淀时不要放在低温,。(5)DNA溶解时可以放在4℃静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。(6)水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。水样DNA间接提取法:(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。(2)采取差速离心取得水样中的菌体。(3)取得微生物后进行裂解提取。此方法还在查证中,具体前期对样品的处理方法还在整理中。例如:用多少的水样进行浓缩,差速离心的转速选择。会不会有DNA的丢失等等。Epicentre推出了宏基因组DNA分离试剂盒(MetagenomicDNAIsolationKitforWater),能从水样中分离已随机剪切的,可直接用于fosmid克隆的DNA片段。此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物(包括革兰氏阳性菌)中提取40kb大小的DNA。提取的DNA可立即进行末端修复,1FOS载体上。优势:,琼脂糖块或大小选择。。,从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。。下图为方法与流程:粗提DNA的纯化采用直接