文档介绍：第一节概述基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/***仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学****基因组DNA提取的一般方法。第二节从植物组织提取基因组DNA 一、材料水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。二、设备移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖),弯成钩状的小玻棒。三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ:100mmol/LTris·Cl,,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,%SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ:,,,240ul巯基乙醇,加水至300ml。 3、80:4:16/***仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液:配方见第一章。 5、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。四、操作步骤: (一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 Ⅰ,60℃水浴预热。 -10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。 ***仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 。 ,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。 ,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。 ,上清液倒入干净的5ml离心管。 (10μg/μl),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。 ×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。 ,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。 ,-20贮存。 %Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。[注意]5g样品可保证获得500μgDNA,足供RFLP、PCR等分析之用。(二).从李(苹果)叶子提取基因组DNA -5克嫩叶,液氮磨成粉状。 Ⅱ10ml,再研磨至溶浆状。10000rpm,10min。 ,沉淀加提取液Ⅰ20ml,混匀。65℃,30-60min,常摇动。 (一)中步骤3-13操作。第三节从动物组织提取基因组DNA 一、材料哺乳动物新鲜组织。二、设备移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。三、试剂 1、分离缓冲液:10mmol/LTris·,10mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA。 2、其它试剂:10%SDS,蛋