文档介绍：第15章高效液相色谱法(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
一概述
二基本原理
三固定相与流动相
四反相色谱
五仪器
六应用和实例
第一节概述
优缺
经典LC 适用范围广效率低,周期长
GC 高效、高速, 稳定,挥发性好
高灵敏度、自动化仅20%能用GC
HPLC:由经典LC→HPLC有三个突破
1、高效填料:5μm 10μm 高效 n=几万/m
2、高压泵输液高速 ~10ml/min
3、高灵敏度的检测器高灵敏度 10-9 g/ml(UV)
(在线检测)
适用范围广制成溶液,不需气化
流动相选择范围宽组成、比例、盐浓度、pH
HPLC流程图
PUMP Detector
Recorder
Waste
HPLC分类与经典LC同。
各国药典收载情况
USP 19版 1975年 7
20 76
21 340
22 871
23 1200+519+206
24 1386
ChP 1985 8
1990 76
1995 186
2000 257
发展迅速。
第二节基本原理
(一)色谱峰展宽与柱效
1. 柱内展宽——范氏方程
H = A + B/u + Cu
5
HPLC:B=2γDm中Dm比GC中小10 倍,忽略第二项。
H=A+Cu = A+(Cs+Cm)u
22
Cms dpp C d
= 2λd +( )u 流动相+静态流动相
p DD
降低H的途径: ms 传质阻抗
(1) dp↓,H↓,n↑采用小粒度固定相
(2) λ↓,H↓填充要均匀。
(3) Dm↑,流动相粘度↓,H↓,n↑如η甲醇=。
采用低粘度流动相。室温。
(4) u ↓,H ↓,n ↑采用较低流速1ml/min 。
2. 柱外展宽——柱外死体积
进样器+色谱柱和进样器的连接管+检测器的死体积
GC φ 4mm 2-4m Dm大,
HPLC φ 2-6mm - 小,
死体积越小越好
(二)分离度及其影响因素
n 1 k
R 2
4 1 k2
n、α、k ↑,R ↑
1、 k↑,峰变矮,分离时间↑, R↑, k最适宜范围1<k<5。
改变流动相极性。
吸附或正相色谱:流动相极性↓,k ↑
反相色谱:流动相极性↑, k ↑
2、改变α—峰间距
α↑,R↑。GC主要通过改变固定相,HPLC主要通过改变流
动相的组成、pH、盐类来改变选择性。
3、n↑,峰变窄,峰变高, R↑
H=A+Cu 如前降低板高的途径。
第三节固定相与流动相
(一)固定相
1. L-S吸附色谱
颗粒细、均匀、球形、耐高压
薄壳型:易装柱,但柱效不高,柱容量小,n1000~5000/m
硅无定形全多孔硅胶: 5、10μm YWG:柱效高,柱容量
胶大,要匀浆装柱。n80000~100000/m
球形全多孔硅胶: YQG:渗透性好。
2. L-L分配色谱固定相:载体+固定液
化学键合相:不流失,稳定≡Si—O—Si — C
载体+有机基团→键合相填料化学键合相色谱
硅基十
硅八 ODS
胶烷烷
非极性键合相: 键合非极性基团:十八烷基硅烷
键合相(C18,ODS)
化学键合相中等极性键合相:醚基键合相(正、反色谱应用,
视流动相极性而定)
极性键合相:键合极性基团(氨基,氰基)
正相色谱(NPC)反相色谱(RPC)
固定相极性大小
流动相极性小大
流动顺序极性小的组分先极性大的组分先
流出流出
流动相极性↑ k↓,tR↓ k↑,tR↑